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1、实验二,土壤微生物的分离纯化与鉴定,一、目的要求,1.通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。2.掌握微生物的鉴定技术,第一部分,培养基的配制与灭菌,一、实验目的,1.学习配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法.3.进一步熟练掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法。,二、实验原理（1）,培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是
2、，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。,二、实验原理（2）,根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下：按成分的不同：天然培养基、
3、合成培养基和半合成培养基。按培养基的物理状态分：固体培养基、半固体培养基和液体培养基。按培养基的用途分：基础培养基、营养培养基（加富培养基）、鉴别培养基和选择培养基。,二、实验原理（3）,目前已有各种商品化的“干燥培养基”成品出售。这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法、真空干燥法、低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理、充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解、分装，高压蒸气灭菌，即可使用。这种培养基的优点是配制省时，携带方便，使用简易，质量稳定。,三、实验器材,1.药品及试剂：根据所要制备的培养基准备所需试
4、剂。2.仪器及其它：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、pH试纸等,四、实验步骤培养基的制备与分装,1.称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。2.熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。3.调pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培养基所需pH。4.过滤：趁热用多层纱布过滤（根据实际情况确定是否过滤）5.分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装
5、三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。6.加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。,四、实验步骤无菌水的制备,1.用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。2.用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。,四、实验步骤器皿的准备,1.培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。2.吸管的包装：首先在吸管的上端
6、塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。3.玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。4.枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。,四、实验步骤高压灭菌,1.将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般121，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113，30min灭菌）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至50左右，倒平板。3.将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。,五、思考题,1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？
7、2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？,第二部分,微生物的分离与纯化,一、目的要求,1.通过从土壤中分离纯化细菌，掌握微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。2.初步掌握微生物的菌种保藏技术。,二、实验原理（1）,自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验将采用平板划线分离法。,三、实验器材,土样培养基无菌的培养皿、三角瓶、水、玻璃珠、玻璃刮刀、吸管、枪尖等
8、,四、操作步骤（1）,制备土壤稀释液涂布平板培养挑菌落平板划线分离菌种保藏（留作鉴定）,四 操作步骤（2）1制备土壤稀释液,四、操作步骤（3）,挑菌落,接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,四、操作步骤（4）,四、操作步骤（4）,常用的接种方法：划线接种点接种穿刺接种涂布接种液体接种注射接种,四、操作步骤（5）,斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞,四、操作步骤（6）,四、操作步骤（7）平板划线法,平板划线分离的方法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5
9、.四格法,四、操作步骤（8）平板划线法,制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀分散在稀释液中。注意无菌操作。,五 注意事项,六 思考题,试拟出从土壤中分离芽孢杆菌的主要实验步骤。如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？,第三部分,分离菌株的鉴定,一、目的要求,掌握常用的微生物鉴定方法。掌握生理生化试验的原理与方法。复习以前学过的各种染色方法,二、实验原理,1、微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。2、各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养
10、的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。,三、实验器材,1试剂：各种染色液、生理生化用试剂等2微生物材料：学生自己分离纯化的菌种3 其他器材：生理生化培养基、接种环、培养箱等,四、操作步骤（1）,记录菌种的培养特征革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性芽孢染色鞭毛染色查伯杰氏手册，初步对菌种进行鉴定。,四、操作步骤（2）,做以下基础实验：一、糖酵解试验二、淀粉水解试验三：V-P试验四：甲基红（Methyl Red）试验然后根据学生自己前期对菌种的初步判定结果，有针对性地加2-3个生理生化实验进一步鉴定。,五、实验报告,根据论文发表格式，写一篇研究性论文。,
