基因工程的酶学基础.ppt

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1、生物技术核心课程,Genetic Engineering基 因 工 程,基因工程纲要,第一章 基因工程概论第二章基因工程的酶学基础第三章基因工程载体概述第四章基因工程的主要技术及原理第五章 目的基因的克隆与分离第六章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定第七章克隆基因的表达第八章基因工程的应用,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链DNA内切酶,核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,第一节 限制性核酸内切酶,一、基本概念及其生物功能,核酸酶：通过切割相

2、邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,第一节 限制性核酸内切酶,一、基本概念及其生物功能,特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase），特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）。,从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶；从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶,按水解断裂核酸分子的方式:,限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,第一节 限制性内切核酸酶,一、基本概念及其生物功能,

3、截至2007年8月，从各种不同的微生物中分离出了限制性内切酶3819种，已经商品化的有624种。,2.性质,主要是从原核生物中分离纯化出来。,内切酶，即在核酸分子链的内部制造切口的酶。,帮助细菌限制外来DNA的入侵,3.功能,1.来源,1,1两种不同来源的入-噬菌体（入-K，入-B）。2能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B 株）。3当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（入K-B，入B-K）感染下降数千倍。4一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株,不能再感染原来 K株.称为：宿主细胞的限制和修饰作用,宿主细胞的限制和修饰作用,限制性内切酶将侵入细菌

4、体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）,供质粒扩增的大肠杆菌菌株多数含有两种位点特异性的DNA甲基化酶：,GATC 腺嘌呤引入甲基,Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上引入甲基,Dam甲基化酶,2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰）,限制和修饰作用的分子机制：,1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株，

5、有各自的限制和修饰系统。,3.外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解-（限制）,限制和修饰作用的分子机制：,4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。,I 型限制性内切酶,目前主要鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型,II 型限制性内切酶,III型限制性内切酶,IV型限制性内切酶,首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB：TGA*(N)

6、8TGCT EcoK：AA*C(N)6GTGC,1.I型限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,N：表示任何一种核苷酸,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）为辅助因子,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约1000-1500 bp处随机切割。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列，多数是回文序列。识别序列长度为46bp，少数识别8bp（表2-2）。,2.II型限制性内切酶,分离的第

7、一个酶是Hind II，其次是 Hind III,5GAA TTC3 3CTT AAG5,特点有二：,回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列,1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5/3/），其核苷酸顺序相同。,5GTNAC3 3CANTG5,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。如：,识别位点处。,DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均一的，对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为：1/4n，n表示该限制酶识别的碱基数。识别

8、4个碱基的，每256（44）个碱基有一个识别序列 识别5个碱基的，每1024（45）个碱基有一个识别序列 识别6个碱基的，每4096（46）个碱基有一个识别序列,切割产生的DNA片段的理论大小为？,限制性内切酶的切割频率：是指限制性内切核酸酶在DNA分子中预测的切点数。,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：,5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,从 5-P

9、末端切割双链DNA的两链，产生5-P单链延伸的黏性末端,EcoR I等产生的5粘性末端,EcoR I 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,3端凸出（如Pst I切点）,CTGCAG,GACGTC,5-,-3,3-,-5,在其识别序列的对称轴两侧，从 3-OH 末端切割双链DNA的两条链，产生具有 3-OH 单链延伸的黏性末端。,Pst I等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,Pst I

10、37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,连接便利,粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。,补平成平齐末端,5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。（5*p-AATTC-OH 3）,粘性末端可以

11、用DNA聚合酶补平成平齐末端。,（4）同裂酶(Isoschizomers),来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。（原型酶同裂酶）,完全同裂酶（同切点酶）,识别位点和切点完全相同 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,不完全同裂酶（新裂酶）：,Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5,识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。,（5）同尾酶（Isocaudamers）,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端

12、。如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,5-RGATCY-3 3-YCTAGR-5,Xho,R代表嘌呤；Y代表嘧啶,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3AI,同尾酶连接后连接处的序列将变得“面目全非”，一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl,在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割D

13、NA双链。,（6）s型限制性内切酶,移动切割（shifted cleavage):,GACGCNNNNN,Hga I,CTGCGNNNNNNNNNN,5,3,3.III型限制性内切酶,有专一的识别序列，但不是对称的回文顺序，在识别序列旁边一定数目核苷酸对的位置上切割双链。但这几个核苷酸对的切割位点不是特异的。,切割产生的DNA片段具有各种单链末端在基因工程操作中用途不大。,EcoPI:AGACC,EcoP15:CAGCAG,4.IV型限制性内切酶,新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的DNA序列。,除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。,核酸限

14、制性内切酶的类型及主要特性,若载体DNA用M酶切开，则带有N酶黏性末端的外源DNA片段中，能直接与载体拼接的是（）M N M NA、A/AGCTT T/TCGAA B、C/CATGG ACATG/GC、GAGCT/C G/AGCTC D、G/GATCC A/GATCT,下列DNA 片段中含有回文结构的是（）GAAACTGCTTTGAC GAAACTGGAAACTG GAAACTGGTCAAAG GAAACTGCAGTTTC,D,D,1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,三、限制性内切酶的命名,用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母（小写，斜

15、体）构成酶的基本名称，表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2.用一个正体字母表示菌株或型。如EcoR、Hind）。,3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示。如Hind I，Hind II，Hind III。,DNA中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。,1.DNA的纯度,四、影响限制性内

16、切酶活性的因素p18,一般采取,纯化DNA 加大酶的用量（510U酶/g DNA）延长保温时间（34h）扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（20 l）加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度,2.DNA的甲基化程度,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37，少数例外。,3.温度,酶切超螺旋DNA分子，所需酶量多于线性DNA分子；最高可达20倍；,4.DNA分子的构型,对同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率具有位点偏

17、爱性；,识别序列的侧面序列影响酶切效率。“保 护 碱 基”,是影响限制酶活性的重要因素。,5.缓冲液(Buffer),缓冲液的化学组成：10Xbuffer,MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：防止酶的氧化，保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,限制酶的星号活性,当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号（*）活性。,所

18、以一般使用专一的反应缓冲液。,星号（*）活性,EcoR I 和BamH I 等都有*活性。EcoR I*,在低盐、高pH（8）时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,GAATTC,EcoR I：,使用的时候要特别注意！,概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：（1）高甘油含量（5,vv）；（2）限制性内切核酸酶用量过高（100UugDNA）；（3）低离子浓度（25 mmolL）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜），乙醇等；（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。,但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（

19、1g加25U酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量,酶过量对酶切反应的影响：1）酶过量（一般为100U/gDNA）会影响识别序列的正确性，如：BamHI 的正常识别序列:GGATTC；酶过量识别序列 NGATCN2）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。,6.酶对消化效率的影响,1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下1h，完全水解1gDNA所需的酶量,五、限制性内切酶对DNA的消化,1.内切酶与识别序列的结合模式,1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II型限制性内切酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,GAA

20、TTC,CTTAAG,两种不同的限制酶切割同一种DNA分子-构建载体。,2.双酶切消化,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用两种酶均适用的缓冲液，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 min、高速冷冻离心10min、干燥,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。,低温酶先切，然后升温，加入高温酶再切,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。,3.完全酶切,1,2,3,4,1,2,3,4,只有有限数量的酶切位点被切开。如构建基因组文库。（p20）,通过缩短

21、保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,4.部分酶切,1,2,3,4,1,4,6.几种常用限制酶识别位点,37酶可用65温育5min高温酶 80温育5min，或用乙醇沉淀DNA。,5.限制酶酶切反应的终止,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,第二节 DNA 连接酶,一、DNA连接酶（ligase)的发现,1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶，“分子黏合剂”。,修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键（分子间及分子内）,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,

22、3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,二、DNA连接酶的基本性质与特点,（一）DNA连接酶的基本性质,修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,连接多个平头双

23、链DNA分子（分子间及分子内）：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,不能催化两条游离的DNA单链连接,（2）大肠杆菌连接酶,1.两种DNA连接酶,该酶由大肠杆菌基因组中的lig基因编码能连接粘性末端，平末端连接效率低。,（二）DNA ligase的特点,（1）T4噬菌体的连接酶,从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离的，由DNA30编码的产物不但能连接粘性末端，还能连接平末端（p21 表2-4）。,（3）被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。,（1）DNA 3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。

24、,（2）需要能量、Mg2+,2.DNA连接酶催化的连接反应特点,（4）只封闭双螺旋DNA骨架上的nick。,1.ATP（NAD+）提供激活的AMP。,2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”（AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连）复合物，并释放出焦磷酸PPi。,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+,+H3N,AMP,ATP,PPi,三、连接反应的机理,3.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,4.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。,连接酶反应的最佳

25、温度是37。,四、影响连接反应的因素,1.反应温度,37下粘性末端的结合很不稳定，一般416。,平末端 1020。,2.连接酶的浓度,在平末端DNA的连接反应中，最适的反应酶用量为12U，而黏性末端仅为0.1U便能达到连接的最佳效果。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,4.插入片段与载体的浓度比例 p24,外源DNA与载体DNA的摩尔比：10:1 或更高,当连接温度在1216之间时，连接反应时间在116h之间；如果温度更低，则延长反应时间。,3.连接反应的时间,假设连接反应要求载体:插入片段的摩尔比为1:12，如果连接反应中有3kb 的载体有100ng，应加入0.5kb

26、的插入片段多少ng？,1/12=100ng 0.5kb/3kb a插入片段200ng,由限制性内切酶创造的黏性末端的连接属于分子内部连接，而平齐末端的连接则属于分子之间的连接，因此后者反应速度相对慢得多,如何提高其连接效率呢?,1、加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接）2、加大平齐末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会3、加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用4、加入单价阳离子（Nacl)，最终浓度150200 mM5、将平齐末端变成黏性末端,第三节 DNA聚合酶,基因工程中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）2.Klenow fragment 3.T7 DNA聚合酶

27、4.T4 DNA聚合酶 5.修饰过的T7 DNA聚合酶 6.Taq DNA聚合酶 7.逆转录酶,DNA聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。,1.大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）,5 3 聚合酶活性,-OH,5,3,dNTPs,主要用来制备带放射性标记的DNA探针。,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA Pol I）的性质,底物：,dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）,Mg2+,带有3-OH游离端的引物,DNA模板,（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,标记,核酸探针

28、（probe）,能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的特定的DNA片段。,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,（3）用DNA聚合酶I 制备探针,标记,已知序列的核酸片断,探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,切口转移法(nick translation)：,DNA聚合酶I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。,探针的标记方式,53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。,切口,切口,5,5,3,3,5,3,5,3,纯

29、化的DNA片断,DNase I 制造单链切口,DNA Pol I 进行切口转移,一种 32P-dNTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32P-dNTP,32P-dNTP,从头至尾都被标记,2.Klenow fragment,具有53聚合酶活性和35外切酶活性。,（1）Klenow fragment的性质,DNA Pol I Klenow fragment(76KD）,枯草芽孢杆菌蛋白酶处理，失去了53外切酶活性,3端补平,5,5,klenow,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端，修复带裂口的DNA,klenow,（2）主要用途,3隐蔽末端的DNA片

30、断,Klenow fragment补平,根据末端的序列选择一种-32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-dGTP,25oC 1h,cDNA第二链的合成,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,（1）T4 DNA聚合酶的性质,3.T4 DNA聚合酶,从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中

31、分离纯化。由噬菌体基因43编码。,有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。,来源,酶活性,特点,当没有dNTP时，T4 DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。,如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA聚合酶,无dNTPs,T4 DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,（2）T4 DNA聚合酶的用途,标记末端（取代合成法）,用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的32P-dNTP。标记的dNTP逐渐取代被删除掉的原有的核苷酸，因此叫做取

32、代合成。,补平3隐蔽末端,将双链DNA的3粘末端转化为平末端,DNA 3末端标记,具EcoRI位点的DNA分子,对DNA分子3端有控制的降解,合成作用产生选择性标记,T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA片段,4.T7 DNA聚合酶,（1）来源,从T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：,T7基因5编码的大亚基：,有53聚合酶和35外切酶活性。,大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。,（2）T7 DNA聚合酶的特点,持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链，合成DNA长度大。,35外切酶活性很高,为Klenow片段的1000倍,合成不受DN

33、A二级结构的影响,其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍,进行末端标记,催化大分子模板的DNA合成,如M13,补平隐蔽末端,（3）T7 DNA聚合酶的用途,取代合成法标记3末端。,与T4 DNA聚合酶相同。,合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。,5.修饰后的T7 DNA聚合酶,（1）T7DNA聚合酶的化学修饰,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。,（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途,双脱氧法进行长片段DNA测序的理想用酶，“测序酶”,标记DNA 3隐蔽末端,更有效地补平末端,6.Taq DNA聚合酶,最早来源于水生栖热菌,耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶。,（1）

34、来源,（3）Taq DNA聚合酶的性质,无校正功能，高保真酶-Pfu DNA聚合酶b.PCR产物可以进行T-A克隆,（2）应用,PCR，最适反应温度75-80，150bp/s,7.反转录酶,最普遍使用的是来源于禽类成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）：,依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。,（1）来源,（2）AMV的性质,由和两条多肽链组成。,RNA肿瘤病毒。,有反转录活性和 RNaseH活性。,RNaseH：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,反转录酶,3 RNA,5 DNA,3,5,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,

35、5 DNA,3,（3）逆转录酶的用途,合成cDNA,以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,合成DNA探针,用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。,随机引物：,随机顺序形成的寡聚DNA片断。,（理论上它能与各种序列的模板结合）,DNA序列分析,切口平移标记DNA,低,有,中,低,低,低,无,中,中,低,无,高,高,无,快,高,高,快,无,无,无,无,无,有,低,快,中,高,3端补平标记DNA,取代合成法标记DNA,同上，催化大分子DNA合成,测序酶,合成cDNA,PCR,用于核酸操作的工

36、具酶,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链DNA内切酶,第四节 DNA修饰酶,一、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）,1.TdT的基本特性,不需要模板！,需要3-OH、二甲胂酸缓冲液。,53DNA聚合酶活性（逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子3-OH末端）,随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,底物可以是：单链DNA 3-OH突出的双链DNA 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以,DNA 5,3,TTT,dTTP，末端转移酶,2.末端转移酶的用途,（1）同聚

37、物加尾克隆DNA片段,给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。,外源DNA,载体DNA,5,3,5,3,CCC,CCC,GGG,GGG,dGTP,dCTP,末端转移酶,（2）再生酶切位点,便于回收克隆片断。,AAGCTT TTCGAA,5,5,Hind酶切,A TTCGA,AGCTT A,Klenow补平,AAGCT TTCGA,AGCTT TCGAA,AAGCATTT TTCGA,AGCTT TTTTCGAA,末端转移酶,AAA,AAA,外源DNA,（3）标记DNA片断的3端,AAGCTTTT TTCGA,AGCTT TTTTCGAA,AAA,AAA,Hind

38、位点,Hind位点,连接,具有放射性同位素32P的dNTP、ddNTP为底物非放射性标记物：生物素-11-dUTP等,二、T4多核苷酸激酶,1.来源,T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。,多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2.功能,催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA、RNA的5-OH端。使已脱磷酸化的5末端重新磷酸化。,3.多核苷酸激酶的用途,催化5-OH末端磷酸化，便于DNA分子连接；标记DNA或RNA的5端,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP,多核苷酸激酶,（1）正向反应（fo

39、rward reaction）,（2）交换反应（exchange reaction）,反应混合物中具有超量ADP和(-32P)ATP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端的磷酸交换。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP、ADP,多核苷酸激酶,效率低于正向反应，反应效果不理想,三、碱性磷酸酶,1.碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离，具有抗热性,Bacterial alkaline phosphatase，BAP,（1）细菌性碱性磷酸酶,（2）小牛肠碱性磷酸酶,Calf intestinal al

40、kaline phosphatase，CIP,从小牛肠中纯化，比活性比BAP高1020倍,加热70，10min可完全失活,2.碱性磷酸酶的特性,催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸基团。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3.碱性磷酸酶的功能,（1）去除DNA或RNA分子的5末端磷酸基团，防止线性化的载体分子自我连接,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTT TTCGAA,Hind酶切,A-OH TTCGA-P,P-AGCTT HO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,A-OH TTCGA-OH,HO-AGCTT HO

41、-A,OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,酶切后的外源DNA的5端有P，能与脱磷酸的载体OH连接,3,P-AGCTT,A-OH,5,3,HO-A,TTCGA-P,5,外源DNA,A TTCGA,AGCTT A,AGCTT,A,A,TTCGA,连接酶,-OH与-OH连不住,其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复,3,P-AGCTT,A-OH,5,3,HO-A,TTCGA-P,5,外源DNA,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性

42、磷酸酶,（2）与多核苷酸激酶共同作用，标记DNA5末端,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链DNA内切酶,第五节 核酸外切酶（Exonucleases）,从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸,一、单链DNA外切酶,1.大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）,53外切,识别5-OH,2.大肠杆菌核酸外切酶（exo）,53、35外切,产生短的225bp的寡核苷酸片段,识别3-OH、5-P,二、双链DNA外切酶,1.核酸外切酶（exo）,35外切,识别3-OH,主要用途：,在DNA双链的末端产生出单链区域。,5,5,

43、5,5,exo,与Klenow配合进行3端标记,-OH,HO-,2.核酸外切酶（exo）,53外切。,主要用途：,使DNA双链变成单链,5 P-,-P 5,5,5,exo,成为测序模板。,识别5-P（但不能降解5-OH）,3.T7基因6外切核酸酶,53外切。,用途与 exo一样，但活性较低用于5端有控制的匀速降解,既能识别5-P，又能识别5-OH。,5,5,5,5,53,5-OH,53 35,5-P 3-OH,3-OH,35,53,53,5-P,5-P 5-OH,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链DNA内

44、切酶,（1）内切单链DNA或RNA，催化其降解,S1,5 dNMPs 或 5 rNMPs,第六节 单链内切核酸酶,一、S1核酸酶,低水平Zn2+，pH4.04.3,1、S1核酸内切酶的功能,高度单链特异性,（2）切掉双链核酸中的单链区,S1,S1,双链分子中的单链区：发卡结构或有缺口的部位。,Zn2+,Zn2+,（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链 不能识别单个碱基对的错配,ATGCAT GCATGC,TACGTA CGTACG,T,甚至能识别单个核苷酸的单链区！,（3）降解限制酶切形成的单链突出端。,5 dNMPs 或 5 NMPs,ssDNA or RNA,二、Bal 31核酸酶

45、,1.功能,既有单链特异的DNA（RNA）内切酶功能；又有双链特异的DNA外切酶功能。,降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。,3.Bal31的用途,定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应。,2.反应条件,Mg2+、Ca2+,与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原DNA中的位置。,用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加入EGTA终止反应，再酶切电泳。,Bal31控制消化法：,EcoR I,EcoR

46、I,BamH I,Hind III,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,Bal31,Hind III,EcoR I,BamH I,Marker,Hind III,EcoR I,BamH I,Marker,对照,DNA 载体经 Hind 切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源 DNA 的连接效率，常用的防止载体自连的方法有 和。,切口平移是指在 的作用下，使 带上放射性标记。,在酶切缓冲液中，一般需加入 BSA，请问加入 BSA 的作用是。,下列哪一种酶作用时需要引物（）A、末端转移酶 B、反转录酶C、DNA 连接酶 D、限制酶,下列DNA 片段，最可能含有

47、SstI 酶切位点的是（）GGAGAGCTCT GAGCACATCT CCCTGTGGGA ATCCTACATG AACCTTGGAA,若将含有 5 末端 4 碱基突出的外源 DNA 片段插入到含有 3 末端 4 碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是（）I.T 4-DNA 聚合酶 II.Klenow III.T 4-DNA 连接酶 IV.碱性磷酸酶 III II+III I+II+III I+II+III+IV,思考题,DNA连接酶的作用特点有哪些？大肠杆菌DNA聚合酶I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有的重要用途,