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1、基因工程制药（2）,上次课内容的回顾(1),基因工程对药物改造的应用实例利用基因工程生产药物的优点,上次课内容的回顾(2),利用基因工程技术生产药品有什么优点？大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；可以提供足够数量的生理活性物质，以便进行深入的研究可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足可以改造；利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,基因工程制药,1982年第一个基因工程产品-人胰岛素在美国问世。,第三节 基因工程药物生产 的基本过程,基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗
2、传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。,基因工程基本过程,基因工程制药的主要程序,目的基因的克隆 构建DAN重组体 DAN重组体转入宿主菌 工程菌发酵(发酵罐1；2)5.表达产物的分离纯化 6.产品的检验等,制备基因工程药物的一般程序,获得目的基因,组建重组质粒,构件基因工程菌或细胞,培养工程菌,产物分离纯化,除菌过滤,半成品检定,成品检定,包装,下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化
3、控制等。,工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，并对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因的高效表达发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物的产品，需要建立一系列的、相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。,生物制药中所用菌种的获得途径：诱变育种基因工程构建细胞工程自然界分离,基因工程药物的生产过程,上游构建（基因工程）,发酵生产（发酵工程）,纯化制备,一、构建过程示意图,从细胞中分离出目的DNA,第四节 目的基因的获得,应用基因工程技术生产新型药物，首先必须构建一个特定的目的基因无性繁殖系，即产生各种新药的不同的基
4、因工程菌株。来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，是不能进行直接分离的。所以，需要采用一些技术获得真核细胞的基因用于新型药物的合成。,克隆真核基因的方法,克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法，RT-PCR。一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。,为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA(cDNA的第一链)，再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶(或者Klenow酶大片段)作用
5、下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。,cDNA克隆示意图,一、逆转录法步骤,mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克隆(载体)将重组体导入宿主细胞 cDNA文库的鉴定 目的cDNA克隆的分离和鉴定,二、RT-PCR法1985年聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)创立后，将它与逆转录方法结合起来，得到一种新的合成cDNA的方法，即逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）。该方法是mRNA逆转录合成cDNA第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。,具备
6、的条件：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。,三、化学合成法,三、化学合成法（2）,用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火，成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,人工化学合成基因的限制（1）,不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段为 50 60 bp，因此只适用于克隆小分子肽的基因。,人工化学合成基因的限制（2）,遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可
7、能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。费用高。,四、其他方法,1、编码序列富集法2、岛屿获救PCR法3、动物杂交法4、功能克隆法5、构建cDNA文库6、差异显示技术的应用7、对已发现基因的改造,1、编码序列富集法利用磁场力对cDNA文库中的目的基因进行富集的一种技术。将质粒DNA库用识别位点较多的酶酶切后连上接头，用5端用生物素标记的与接头序列相同的引物进行PCR扩增。将cDNA文库的插入片段同样扩增后，两者杂交得到带有生物素的DNA双链，当溶液中加入含有磁珠核心的链霉抗生素蛋白时，DNA双链结合到磁株上，在外加磁场的作用，目的基因与其他的DNA片段分离，达到富集的目的。,2、岛屿获救PCR
8、法直接从已测序的基因组DNA上寻找编码序列，通过计算机分析找出开放阅读框，采用外显子陷阱法和寻找CpG岛的方法克隆编码基因。,3、动物杂交法许多基因由于进化过程中存在保守性而在人和其他物种中具有高度同源性，因此利用已知序列的其他物种的基因从构建的人基因组文库或cDNA文库中可以将目的基因调出。,4、功能克隆法依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法称为功能克隆法。该法不适于在不知道基因相关功能信息的条件下有效地可隆新的基因。可采用基因敲除技术、RNA干扰技术、酵母双杂交技术、高通量表达技术及流式细胞技术等手段，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平、细胞水平获得基因功能信息。,5、构建cDNA
9、文库通过表达序列标签(expressed sequence tag,EST)进行基因作图和基因组序列中编码序列的鉴别，EST能提供设计引物的足够信息，可以用PCR技术扩增基因组中特异片段，是一种有用的DNA位标。,6、差异显示技术的应用用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因或沉默基因，从而推测其可能是癌基因或抑癌基因。,7、对已发现基因的改造用基因修饰或点突变技术以提高目的基因表达产物的稳定性和体内的半衰期，提高表达产物的生物学活性，降低有效使用剂量或提高表达量，降低毒性或免疫原性。,第三章 基因工程制药思考题（2）,1、简述制备基因工程药物的一般程序，其中上游和下游分别包括哪些过程？2、在基因工程药物生产中下游工作的重点是什么？3、生物制药的菌种获得途径主要有哪些？4、从真核细胞中获得目的基因的主要途径有哪些？,
