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1、高级生物化学及实验,主要内容,氨基酸的分析蛋白质的分析核酸的分析两个实验,第一章、氨基酸的结构及性质 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,第一节 氨基酸的分类,一、氨基酸的结构通式,氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1).与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸(2).除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨
2、基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,二、常见氨基酸的分类,中性AA（1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA 疏水性R基团AA（2）按R基团的电性质分 电荷极性R基团的AA 带电荷R基团的AA,（3）按R基团的化学结构分 芳香族AA 杂环族AA,（一）按R基的化学结构分类 可分为三类：脂肪族、芳香族和杂环族 1、脂肪族氨基酸 含一氨基一羧基的中性氨基酸,甘氨酸 Gly,G,丙氨酸 Ala,A,缬氨酸 Val,V,亮氨酸 Lue,L,异亮氨酸 Ile,I,丝氨酸(Ser,S),苏氨酸(Thr,T),半胱氨酸(Cys,C),甲硫氨酸(Met,M),含
3、羟基或硫氨基酸(一氨基一羧基),酸性氨基酸(一氨基二羧基)及其酰胺,天冬氨酸(Asp,D),谷氨酸(Glu,E),天冬酰胺(Asn,N),谷氨酰胺(Gln,Q),碱性氨基酸(二氨基一羧基),赖氨酸(Lys,K),精氨酸(Arg,R),组氨酸(His,H),杂环,2、芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trp,W）,3、杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,说明：关于杂环氨基酸和杂环亚氨基酸,色氨酸（Trg,W）,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,芳香族氨基酸,杂环亚氨基酸,杂环氨基酸,非极性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（
4、二）按R基的极性性质的分类,*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,1.酸性氨基酸,2.碱性氨基酸,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,3.非极性疏水性氨基酸,饼干写亮一本谱,色氨酸 tryptophan Trp W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyr
5、osine Tyr Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,4.极性中性氨基酸,3个有个性的氨基酸,1）脯氨酸（Pro）因为是一个环状的亚氨基酸,它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的肽键有明显的特点,较易变成顺式肽键.,2）甘氨酸（Gly）是唯一的在-碳原子上只有2个氢原子,没有侧链的氨基酸.为此它既不能和其它残基的侧链相互作用，也不产生任何位阻现象,进而在蛋白质的立体
6、结构形成中有其特定的作用.,3）半胱氨酸(Cys)它的个性不仅表现在其侧链有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还在于两个 Cys 能形成稳定的带有二硫（桥）键的胱氨酸。二硫键不仅可以在肽链内，也可以在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键能具有不同的空间取向。,半胱氨酸,胱氨酸,人体所需的八种必需氨基酸 赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)色氨酸(Trp)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)苏氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)早产儿所需：色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys),（三）不常见的蛋白质氨基酸,存在于少数蛋白质中特殊的氨基酸，是
7、在蛋白质生物合成后由相应的基本氨基酸衍生而来。,N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中。,-羧基谷氨酸存在于凝血酶原中;,羟脯氨酸存在于胶原蛋白中;,（四）非蛋白质氨基酸,大多是蛋白质中存在的L型-氨基酸的衍生物。但有一些是、或-氨基酸，且有些是D-型氨基酸。,细菌细胞壁组成中的肽聚糖中的D-氨基酸：D-谷氨酸、D-丙氨酸一种抗生素短杆菌肽S中含有D-苯丙氨酸。,-丙氨酸是遍多酸(泛酸,一种维生素)的前体成分 氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质,L-鸟氨酸、L-瓜氨酸是尿素循环的中间体,第二节 氨基酸的重要理化性质和功能,一、一般物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点极高(一般在200以上)。有的无味、有的味
8、甜、有的味苦、谷氨酸的单钠盐有鲜味(味精的主要成分)。,1、溶解性 氨基酸在水中的溶解度差别很大,除胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸外,一般都能溶于水,并能溶解于稀酸或稀碱中,但不能溶解于有机溶剂(通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出)。脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中,且二者极易溶于水而潮解。,2.氨基酸的旋光性,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,氨基酸的构型都有 D-型和 L-型 2 种立体异构体,蛋白质中发现的氨基酸都是L-型的（故习惯上书写氨基酸都不注明构型和旋光方向）。,3、紫外吸收,构成蛋白质的20种
9、氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,Phe：max=257nm，257=2.0102 mol-1Lcm-1 Tyr：max=275nm，275=1.4103 mol-1Lcm-1 Trp：max=280nm，280=5.6103 mol-1Lcm-1,分光光度计定量分析依据,Lambert-Beer定律：A=Log 1/T=Log Io/I=C L,
10、L-B 定律 可表述为：当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和厚度(L)的乘积成正比。它是分光光度法定量分析的依据。,1、两性解离和等电点,两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO-负离子。氨基酸是两性电解质。,二、氨基酸的化学性质,pH=pI 净电荷=0,pH pI净电荷为正,pH pI净电荷为负,(pK1),(pK2),在一定pH条件下,氨基酸分子中所带的正电荷数和负电荷数相等,即净电荷为零,在电场中既不向阳极也不向阴极移动,此时溶液的pH值称为该种氨基酸的等电点(isoelectric point，pI)。氨基酸
11、的等电点是它呈现电中性时所处环境的pH值.,（1）等电点的概念,A.等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。利用该性质可分离制备某些氨基酸。例如谷氨酸的生产，即将微生物发酵液的pH值调至3.22（谷氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。B.利用各种氨基酸的等电点不同，可通过电泳法、离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。氨基酸的等电点可由其分子上解离基团的解离常数来确定。,（2）等电点理论的应用,（3）氨基酸等电点的计算,可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子两侧的基团pK值之和的二分之一。,一氨基一羧基AA的等电点计算，以丙氨酸为例:,一氨基二羧基氨基酸等电点的计算,以As
12、p为例:,二氨基一羧氨基酸的等电点的计算,以Lys为例：,2.氨基酸参与的化学反应,（1）与茚三酮反应,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,反应要点A.该反应由NH2与COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值D.测定范围：0.550g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离）B.氨基酸自动分析仪：用阳离子
13、交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,（2）与甲醛反应,反应特点A.为-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,(3)与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,反应特点A.为-NH2的反应B.氨基酸-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基
14、苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与-DNP氨基酸区分和分离,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,由Edman于1950年首先提出为-NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链
15、N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分离PTH-氨基酸层析法鉴定Edman降解法的改进方法-DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量,第三节 氨基酸的分离与纯化技术,一、电泳举例：Glu、Leu、His、Lys 4种氨基酸的混合样品，在pH
16、6.0时，泳动方向及相对速度。Glu Leu His Lys pI 3.22 5.98 7.59 9.74,二、层析,层析即色层分析又称色谱(chromatograph)固定相(stationary phase)流动相(mobile phase)1891年Nerst提出分配定律，即：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数称为分配系数(Kd)。,物质分配不仅在互不相溶的两液相间分配，也可以在固相-液相间或在气相-液相间分配层析系统中的静相可以是固相、液相或固-液相混合相（半液体）；流动相可以是液相或气相，它充满于固定相的空隙中，并能流过固定相
17、。,有效分配系数Keff,Keff=,某一物质在流动相中的总量,某一物质在固定相中的总量,根据层析的分离原理分类：吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法 凝胶层析法（排阻层析法）亲和层析法 疏水层析法,根据层析的操作方式分类：柱层析法 薄层层析法 纸层析法 薄膜层析法 高效液相层析法（HPLC）,1、柱层析分配层析,可以同检测器、记录仪、馏分收集器、输液泵构成层析系统。,2、薄层层析吸附层析 分辨率高、所需样品量微、层析速度快,薄层层析介质纤维素粉、硅胶和氧化铝粉,盖子,层析缸,层析板,溶剂,3、纸层析分配层析,Rf主要与R基的极性有关，溶剂的pH可影响R基的极性，氨基酸与滤纸的吸附作用也影响Rf。,纸层析中的Rf值,Rf=,溶剂前沿,氨基酸显色点,滤纸,原点,4、离子交换层析一种用离子交换树脂作支持 剂的层析方法,4,氨基酸的离子交换分离原理,若pIpH，两性离子带净正电荷，若pI pH，两性离子带净负电荷。差值越大，所带的净电荷越多。,用氨基酸自动分析仪分析氨基酸混合物的洗脱曲线（阳离子交换剂）。洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷与离子交换树脂的静电吸引和疏水相互作用两者的综合作用的结果。,
