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1、紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,1.紫外可见吸光光度分析方法2.紫外可见吸光光度分析方法的应用举例3.Win-sp分光光度计工作站功能4.Win-sp分光光度计工作站使用指导,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,1.紫外可见吸光光度分析方法1.1吸光光度分析法基本概念1.2紫外可见吸光光度分析法浓度因子定量计算标准曲线法定量计算双波长吸光光度法多波长吸光光度法动力学吸光光度法光谱分析导数光谱分析1.2.8 其它吸光光度法分析方法,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,2.紫外可见吸光光度分析方法的应用举例 2.1 在环境保护中的应用举例 空气中“甲醛”的测定 2.2 在食品安全中的应用
2、举例 食品中“农药残留”的快速检测 2.3 在生命科学研究中的应用举例 DNA/蛋白质浓度检测 2.4 在医药分析中的应用举例 小儿用盐酸麻黄素滴鼻剂的导数光谱测定法,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,3.Win-sp分光光度计工作站功能 3.1 基本测试功能 3.2 具体应用功能 3.3 辅助功能,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,4.Win-sp分光光度计工作站使用指导 4.1 软件的安装 4.2 联机 4.3 光度测试演示 4.4 时间扫描演示 4.5 光谱扫描演示 4.6 多波长演示 4.7 农药残留检测演示,3.Win-sp分光光度计工作站功能 3.1 基本测试功能,3.1.
3、1 光度测试工作模式3.1.2 时间扫描工作模式3.1.3 标准曲线工作模式3.1.4 光谱扫描工作模式,3.Win-sp分光光度计工作站功能 3.2 具体应用功能,3.2.1 多波长工作模块 3.2.2 室内环境检测工作模块 农药残留快速检测工作模块 3.2.4 DNA/蛋白质浓度检测工作模块,3.Win-sp分光光度计工作站功能3.3 辅助功能,3.3.1 文件的存储 3.3.2 图形处理 3.3.3 报告打印 3.3.3 邮件发送,1.1 吸光光度分析法基本概念,吸光光度分析法理论依据 吸光光度分析法是基于不同的分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的分析方法，属于分子吸收光谱分
4、析。在某一特定波长光的作用下，物质的浓度和吸光度值成正比；在某物质的浓度不变的情况下，改变作用光的波长，吸光度也将发生变化，这表明，分子的吸光度值（A）和波长（）为函数关系，同时和该组分的浓度（C）为函数关系。这就是吸光光度法定量分析和定性分析的理论依据。,1.1 吸光光度分析法基本概念 1.1.2.2 分光光度计吸光度值的计算,分光光度计检测器中的模拟信号经A/D转换为数字信号，保存到存储器中，这个值我们称为能量值（Energy），透过率的计算就是基于能量值。透过率（Transmittance）：T=（Es-E0）（E100-E0）100%吸光度（Absorbance）：A=-log 10T
5、 E100：吸收池中为参比（可能是空气）时的能量值 E0：无光束通过吸收池时的能量值 Es：吸收池中为待测样品时的能量值,1.2紫外可见吸光光度分析法 浓度因子定量计算,紫外可见吸光光度分析法有定量分析和定性分析；但以定量分析为主。浓度因子定量计算 溶液的某组分的浓度C和吸光度A之间存在线性关系，当A和C之间的关系确定时，浓度C可以直读，令K为浓度因子，有 C=K A 浓度因子K的取得 1。由已知浓度的标准样品的吸光度值中计算出 K=C A 2。由标准曲线法获得,1.2紫外可见吸光光度分析法 标准曲线法定量计算,先配制一系列浓度不同的标准溶液，在与试样相同的条件下，分别测量其吸光度，将吸光度与
6、对应的浓度做图，所得的直线称为标准曲线或工作曲线。然后测定试样的吸光度，再从工作曲线中查出试样的浓度。计算机中标准曲线法定量计算数据处理采用回归分析法。确定回归直线的原则是使它与所有实验点的误差的平方和为最小值。设回归方程为：y=a+b x利用最小二乘法原理，求出回归线的斜率b和截距a。r为Y 和x 变量之间的相关系数 当 r 0.999 时 表明Y 和 x 之间存在线性函数关系。,1.2 吸光光度分析法 双波长吸光光度法,原理：以样品溶液本身做参比，用两束强度相等、波长不同的单色光交替入射到同一样品溶液，测得吸光度A1、A2。设两波长吸光度之差为A，样品溶液某组分浓度为C，样品溶液某组分浓度
7、和A之间因子为K。有：A=A1-A2C=A K双波长吸光光度法主要特点：可以对浑浊试样进行分析可以进行双组分或三组分混合物同时测定在药物分析中有广阔的使用。,1.2 吸光光度分析法 多波长吸光光度法,原理：以样品溶液本身做参比，用多束波长不同的单色光交替入射到同一样品溶液，测得吸光度A1、A2.An。设每个波长吸光度对应的系数K1、K2 Kn，设A为所有波长吸光度的代数表达式之和，样品溶液某组分浓度为C，样品溶液某组分浓度和A之间因子为K。有：A=Ki AiC=A K 其中的系数K1、K2 Kn为经验值,1.2 吸光光度分析法 动力学吸光光度法,动力学吸光光度法是通过研究样品吸光度随时间变化规
8、律，来分析化学反应等平衡过程状态，或借此方法分析某种组分的一种方法。一般可分为三类：催化动力学方法（包括酶催化动力学方法）非催化动力学方法（包括差动力学方法）诱导方法测量方法：起始斜率法、固定时间法、固定浓度法。动力学吸光光度法最基本的测量方式就是时间扫描。通过时间扫描，我们可以得到样品吸光度A的时间数列A1、A2、A3.An 对这个时间数列我们可以得到A的几个统计指标：动态范围平均值 标准差平均差变异系数-标准差变异系数,1.2 吸光光度分析法 光谱分析,光谱分析光谱分析是通过研究样品吸光度随波长变化规律，来分析样品的光谱（这里狭义为紫外-可见光谱）特征，并通过对比某种物质的标准图谱，来定性
9、分析组分性质，并为下一步定量分析提供依据的一种分析方法。光谱分析最基本的测量方式就是波长扫描。通过波长扫描，我们可以得到样品吸光度A的谱图数据A1、A2、A3.An对这个谱图数据我们常规处理就是光谱波峰波谷的扫描，对某个特征峰，我们可以由下面几个属性来描述：波长 峰高 峰类型,1.2 吸光光度分析法 导数光谱分析,导数光谱分析有一阶导数光谱、高阶导数光谱分析。它是普通光谱分析的补充，当样品的两种组分在普通光谱分析中无法识别时，可以考虑导数光谱分析。导数光谱的获得有两种方式：直接通过同时记录两波长的A，进行一次完整扫描即可获得。在计算机内通过程序对普通光谱扫描的结果进行求导获得。对这个谱图数据我
10、们常规处理就是同样是光谱波峰波谷的扫描，对某个特征峰，我们也可以由几个属性来描述（同光谱分析）,1.2 吸光光度分析法 1.2.8 其它吸光光度法分析方法,正交函数吸光光度法混合组分的测定流动注射吸光光度法差示吸光光度法浮选吸光光度法固相吸光光度法计量学吸光光度法（多组分光谱定量方法）最小二乘法逆最小二乘法偏最小二乘法非线性最小二乘法改进矩阵法卡尔曼滤波法,2.1在环境保护中的应用举例空气中“甲醛”的测定,在室内环境检测有五个项目：游离甲醛、氨、氡、苯、总挥发性有机化合物（TVOC），其中游离甲醛、氨两项是用分光光度法分析的。室内环境检测检测以民用建筑工程室内环境污染控制规范 GB 50325
11、-2001及室内空气质量标准GB/T 18883-2002作为标准。“游离甲醛”的检测方法是酚试剂分光光度法,波长为630nm。“氨”的检测方法是靛酚蓝分光光度法,波长为697.5nm。一、“游离甲醛”的检测(1)检验原理空气中的甲醛与酚试剂反应生成嗪，嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物。根据颜色深浅，比色定量。(2)检验仪器及软件1.分光光度计：723可见分光光度计；2.Win_env环保工作站；(3)试剂吸收液：酚试剂C6H4SN（CH3）CNNH2HCI。,2.1在环境保护中的应用举例空气中“甲醛”的测定,(4)工作流程,2.1在环境保护中的应用举例空气中“甲醛”的测定(7)检
12、测示例,2.2分光光度计在食品安全中的应用举例-食品中“农药残留”的快速检测,食品中“农药残留”的快速检测是动力学吸光光度法的一个具体应用。仪器检测过程遵循国家标准GB/T5009.199-2002规定的酶抑制率法来检测蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸脂类农药残留。(1)检验原理检测所用的酶抑制率法是模拟人体温度（37C）环境下，通过测定食品中有机磷和氨基甲酸脂类农药残留对已酰胆缄酶活性的抑制率，来快速判断农药综合残留量。测定波长410nm。(2)检验仪器及软件1.分光光度计：723可见分光光度计；2.Win_Sp农药残毒检测工作站；(3)试剂1.提取试剂2.酶3.显色剂4.底物,2.2分光光度计
13、在食品安全中的应用举例-食品中“农药残留”的快速检测,(4)检测范围及灵敏度蔬菜：叶菜、果菜、豆菜、瓜菜（除胡萝卜、韭菜、茭白、蘑菇）农药：有机磷类：甲胺磷、对硫磷、氧化乐果、敌敌畏、甲拌磷、久效磷、杀扑磷等 灵敏度 0.5-5mg/kg2.水胺硫磷、甲基对硫磷、甲基异柳磷、乐果等 灵敏度 8-10mg/kg氨基甲酸酯类：克百威、涕灭威、丙硫克百威、丁硫克百威、抗蚜威、仲丁威、速灭威、残杀威、西维因、叶蝉散等 灵敏度,（对照组用3毫升提取试剂代替样本提取液）,2.2分光光度计在食品安全中的应用举例-食品中“农药残留”的快速检测,(5)检测流程,2.2分光光度计在食品安全中的应用举例-食品中“农
14、药残留”的快速检测(6)检测示例,2.2分光光度计在食品安全中的应用举例-食品中“农药残留”的快速检测,农残测试界面,2.3可见分光光度计在生命科学研究中的应用举例-DNA/蛋白质浓度检测,蛋白质和核酸均有紫外吸收的性质，蛋白质在280nm波长处的紫外线有最大吸收，核酸及其衍生物在260nm波长处紫外线有最大吸收，可以通过标准曲线法进行定量测定，也可用二波长、三波长方法消除干扰组分的影响，提高测试准确度。1.定点波长（280nm）定量测定蛋白质浓度原理：蛋白质对280nm的紫外线有最大吸收，这是因为含有酪氨酸和色氨酸的缘故，蛋白质溶液的280nm吸收值与其浓度成正比，可作定量测定。仪器：752
15、分光光度计试管1.5*15cm（*9）吸管 0.5ml(*1)、1ml(*3)、2ml(*2)、5ml(*2)。,2.3可见分光光度计在生命科学研究中的应用举例-DNA/蛋白质浓度检测,试剂卵清蛋白标准液：约1g卵清蛋白溶于100ml 0.9NaCl溶液，离心，取上液，用克氏定氮法测定其蛋白含量。根据测定结果，用0.9NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白含量为2mg/ml，将2mg/ml蛋白质的溶液准确稀释1倍未知浓度蛋白质溶液，有酪蛋白配制，浓度控制在范围内。操作：标准曲线的绘制，取8支干净试管，按下表编号并加入试剂：加毕，混匀，用紫外分光光度计计测OD280，以光密度为纵坐标，蛋白浓度为
16、横坐标作图。样液的测定：取未知浓度的蛋白液1.0ml，加蒸馏水3.0ml，混匀，测OD280，对照标准曲线求得蛋白浓度。,2.3.2.双波长法定量测定核酸浓度紫外吸收法,原理 核酸及其衍生物、核苷酸、核苷、嘧啶和嘌呤均有紫外吸收的性质。其吸收高位在260nm波长处。核酸的摩尔消光系统用c(P)来表示，：(F)为每升溶被中含有1克原子核酸磷的光吸收值(即A值)(见下表)。测得未知浓度核酸溶液的A值、即可计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便、迅速，对样品无损。蛋白质和核苷酸等也有紫外吸收。通常蛋白质的吸收高峰在280nml波长处，在260nnl处吸收值仅为核酿的110或更低、因此对于含有微
17、过蛋白质的核酸样品。测定误差较小。RNA的260nm、与280nm吸收比值在2.0以上DNA的260nm和280nm吸收比值在1.9左右当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品中混有大量的蛋白质和核苷酸等紫外吸收物质时，应设法除去。,2.3.3 多波长法定量测定DNA/蛋白质浓度,一、原理 蛋白质和核酸均有紫外吸收的性质，蛋白质在280nm波长处的紫外线有最大吸收，核酸及其衍生物在260nm波长处紫外线有最大吸收，通过三波长方法消除干扰组分的影响，提高测试准确度。二、测定原理波长选择：1230nm：蛋白质明显吸收波长。2260nm：DNA最大吸收波长。3280nm：蛋白质最大吸收波长。432
18、0nm：背景波长。计算方式方式 1：DNA浓度=49.1A260-3.48A230 蛋白质浓度=183.0A230-75.8A260方式 2：DNA浓度=62.9A260-36.0A280 蛋白质浓度=1552.0A280-757.3A260参考指标：A260/280,通常A260/280在1.9左右。故在蛋白质和DNA同时测定中，若样品中混有大量的蛋白质和核苷酸等紫外吸收物质时，应设法除去。,2.3.3 多波长法定量测定DNA/蛋白质浓度-工作示例,2.4 可见分光光度计在医药分析中的应用举例 小儿用盐酸麻黄素滴鼻剂的导数光谱测定法,摘要：目的：建立一种盐酸麻黄素滴鼻剂的含量测定方法。方法：
19、以一阶导数光谱的谷-基振幅值为测定依据，测定波长为216 nm。结果：回收率100.14%，相对标准差0.74%，线性范围7.5617.64 mg.L1。结论：该方法简便、准确、快速，适合于盐酸麻黄素滴鼻剂的含量测定。小儿用盐酸麻黄素滴鼻剂在儿科临床上用于治疗小儿伤风鼻炎、鼻窦炎及肥大性鼻炎等，其含量测定方法有中和法1、比色法2、酸性染料比色法3、旋光法4。采用一阶导数光谱法，不经分离直接测定盐酸麻黄素滴鼻剂的含量，消除了滴鼻剂中氯化钠对测定的干扰，方便简便、准确、快速，可用于该制剂的含量分析。,2.4 可见分光光度计在医药分析中的应用举例 小儿用盐酸麻黄素滴鼻剂的导数光谱测定法-吸收光谱的绘制,由图1，盐酸麻黄素在204 nm波长处有最大吸收，而氯化钠在此也有干扰吸收，故采用普通的紫外分光光度法测定将使结果偏高；在图2中，盐酸麻黄素在216 nm处有一波谷，而氯化钠在此处没有吸收，不影响盐酸麻黄素的含量测定，故采用216 nm处的波谷与基线之间的振幅值为定量信息。,图2,图1,结 束。欢迎指正！,-刘志高 E_mail:,
