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1、蛋白质的合成与加工Protein Synthesis and Processing,第十八章,1954年，Paul Zamecnik及其同事实验证明体内蛋白质是由氨基酸合成的。1956年，他们发现了氨基酰-tRNA合成酶。1958年，M.B.Hoagland和Zamecnik又发现蛋白质生物合成需要可溶性RNA为中介。1961年，Howard Dintzis证明血红蛋白肽链合成方向是从N-末端向C-末端进行。19611966年间，Nirencerg、Matthaei和Khorana先后确定了64个遗传密码。19731976年，麦胚无细胞体系、兔网织无细胞体系分别建立，蛋白质合成的具体过程终于揭
2、晓。,蛋白质的生物合成，即翻译（translation）翻译的过程就是将核酸中核苷酸序列编码的遗传信息，通过遗传密码破译的方式解读为蛋白质分子中20种氨基酸的排列顺序。,蛋白质合成体系的组成Components Required for Protein Biosynthesis,第一节,参与蛋白质生物合成的三种RNA：,mRNA（messenger RNA,信使RNA）rRNA（ribosomal RNA,核糖核蛋白体RNA）tRNA（transfer RNA,转移RNA）,辅助因子包括:起始因子(initiation factor,IF)延长因子(elongation factor,EF)释
3、放因子（终止因子）(release factor,RF)等,氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase),一、mRNA是蛋白质/多肽链合成的模板,在遗传信息传递过程中，DNA转录生成mRNA，mRNA作为蛋白质合成的直接模板，指导蛋白质多肽链的合成。mRNA包括5-非翻译区(5-untranslated region,5-UTR)开放阅读框架区(open reading frame,ORF)3-非翻译区(3-untranslated region,3-UTR),原核生物mRNA,真核生物mRNA,目 录,（一）mRNA含有64种密码子,mRNA分子上每3个核苷酸
4、构建一个密码子，编码某一特定氨基酸或作为蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码(triplet codon)，也称遗传密码子(genetic codon)。,起始密码(initiation codon):AUG,终止密码(termination codon):UAA、UAG、UGA,遗传密码表,目 录,遗传密码具有通用性(universal),（二）遗传密码具有几个特性,从原核生物生物（包括病毒、细菌等）、真核生物以及人类都共同使用同一套遗传密码。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,密码子具有方向性(direction),起始密码子总是位于mRNA开放阅读框架的5末端，
5、终止密码子位于3末端。翻译的方向是从5到3末端。,3.遗传密码具有连续性(commaless),密码子按5 3方向每3个一组阅读框架顺序翻译，无标点、不重叠，即连续性mRNA开放阅读框架内发生一个或两个碱基插入或缺失，可引起移码突变(frameshift mutation)。翻译的蛋白质氨基酸顺序则发生改变。,4.遗传密码具有简并性(degeneracy),目 录,简并性，即同一种氨基酸具有多个密码子，或者多个密码子代表一种氨基酸的现象。遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅对应一个密码子外，其余氨基酸均有一个以上密码子为其编码。,简并性(degeneracy),目 录,5.遗传密码具有摆动性（wo
6、bble）,编码同一氨基酸的不同密码子互称同义密码子；同义密码子之间的差异通常只在第3位碱基上，密码子第3位碱基与tRNA反密码子不严格遵守碱基配对规律，而是摆动碱基配对。,U,摆动配对,目 录,密码子、反密码子配对的摆动性,二、一种tRNA只能转运一种氨基酸但一种氨基酸可由几种tRNA转运,反密码环,氨基酸臂,tRNA的三级结构示意图,三、rRNA与蛋白质组成核糖体,目 录,蛋白质合成场所,核糖体的组成,目 录,原核生物核糖体 70 S Mt 2.7106 真核生物核糖体 80S Mt 4.2106,核糖体在蛋白质合成中有主要作用：,核糖体两亚基上具有结合mRNA的位点，还有与起始因子、延长
7、因子、释放因子及各种酶的结合位点；并且具有两个tRNA结合的位点；A位点是氨基酰tRNA结合位点，P位点是肽酰tRNA结合位点。通过将mRNA、氨基酰-tRNA和相关的蛋白因子放置在正确的位置来调节蛋白质的合成。核糖体是合成蛋白质的场所。,20种氨基酸（AA）酶及众多蛋白因子，如氨基酰-tRNA合成酶、起始因子(initiation factor，IF)、延长因子（elongation factor，EF）、释放因子（release factor，RF）。ATP、GTP无机离子,四、蛋白质合成体系还需要其他辅助因子,大肠杆菌蛋白质合成的5个阶段所需化合物,1,氨基酸的活化,20,种氨基酸,20
8、,种氨基酰,-,tRNA,合成酶,32,种（或多于,32,种）,tRNA,ATP,、,Mg,2+,2,起始,mRNA,N,-,甲酰甲硫氨酰,-,tRNA,fmer,mRNA,上的起始密码子（,AUG,）,30S,核糖体亚基,50S,核糖体亚基,起始因子（,IF,-,1,IF,-,2,IF,-,3,）,GTP,、,Mg,2+,3,延长,具有功能的,70S,核糖体（起始复合物）,密码子特异的氨基酰,-,tRNA,延长因子（,EF,-,Tu,EF,-,Ts,EF,-,G,）,GTP,、,Mg,2+,4,终止与释放,mRNA,上的终止密码,释放因子（,RF,-,1,RF,-,2,RF,-,3,）,5,
9、折叠和翻译后的加工,特异酶、辅助因子、除去起始残基和信号肽所需的化合物，,水解过程，末端残基的修饰，磷酸、甲基、羧基、碳水化合物或辅,基结合到蛋白质上,阶段,必需化合物,1,氨基酸的活化,20,种氨基酸,20,种氨基酰,-,tRNA,合成酶,32,种（或多于,32,种）,tRNA,ATP,、,Mg,2+,2,起始,mRNA,N,-,甲酰甲硫氨酰,-,tRNA,mRNA,上的起始密码子（,AUG,）,30S,核糖体亚基,50S,核糖体亚基,起始因子（,IF,-,1,IF,-,2,IF,-,3,）,GTP,、,Mg,2+,3,延长,具有功能的,70S,核糖体（起始复合物）,密码子特异的氨基酰,-,
10、tRNA,延长因子（,EF,-,Tu,EF,-,Ts,EF,-,G,）,GTP,、,Mg,2+,4,终止与释放,mRNA,上的终止密码,释放因子（,RF,-,1,RF,-,2,RF,-,3,）,5,折叠和翻译后的加工,特异酶、辅助因子、除去起始残基和信号肽所需的化合物，,水解过程，末端残基的修饰，磷酸、甲基、羧基、碳水化合物或辅,基结合到蛋白质上,阶段,必需化合物,蛋白质的合成过程Protein Synthesis Process,第二节,氨基酸的活化肽链合成的起始(initiation)肽链的延长(elongation)肽链合成的终止(termination)及释放,整个翻译过程可分为4个阶
11、段：,翻译过程从开放阅读框架的5-AUG开始向3阅读，按mRNA上三联体密码的顺序指导蛋白质从N端向C端合成，直至终止密码。,（一）氨基酰-tRNA合成酶催化氨基酸与tRNA的连接,一、氨基酸活化成氨基酰-tRNA,氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase),第一步反应:,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi,目 录,第二步反应:,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E,目 录,（型）,氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(editing activity)，即酯酶的活性。
12、氨基酰-tRNA的表示方法：Ser-tRNASerMet-tRNAMet,（二）氨基酰-tRNA合成酶具有校读作用,二、起始阶段形成翻译起始复合物,指在起始因子的作用下，mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物(translational initiation complex)。,原核生物中有3种起始因子(initiation factor，IF)：IF-1、IF-2、IF-3真核生物起始因子被称作eIF(eukaryotic initiation factor)eIF-1、-2、-3、-4、-5和-6,（一）原核生物在起始因子参与下组装翻译起始复合物,1原核生物翻译
13、起始形成70S起始复合物,IF-1、IF-3结合解聚的核糖体30S小亚基；mRNA结合核糖体30S小亚基；在IF-1的作用下，fMet-tRNA结合mRNA的起始密码子；50S核糖体大亚基参入复合物。,原核生物：fMet-tRNAifMet真核生物：Met-tRNAiMet,肽链合成的起始氨基酰-tRNA:,IF-3,IF-1,（1）IF-3、IF-1结合解聚的30S核糖体小亚基,目 录,IF-3,IF-1,（2）mRNA结合核糖体30S小亚基,目 录,S-D序列（Shine-Dalgarno sequence）又称核糖体结合位点（ribosomal binding site,RBS）,IF-
14、3,IF-1,（3）在IF-1的作用下，fMet-tRNA结合mRNA的 起始密码子,目 录,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,(4)利用IF-2具有GTP酶的活性，催化GTP水解，起始因子释放，50S大亚基与30S小亚基结合，形成70S起始复合物，fMet-tRNAfMet位于核糖体上的P（peptidyl）位。,目 录,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,目 录,（二）真核细胞蛋白质合成起始机制与 原核相似但更复杂,真核细胞的蛋白质合成过程中需要更多的蛋白质因子，步骤更为复杂，但基本过程与原核细胞中相似。,1.真核生物的核糖体为80S,2.真核生物的起始
15、氨基酸是甲硫氨酸，而不是N-甲酰甲硫氨酸。,3.AUG是真核生物中起始密码子，mRNA 的5末端AUG一般就是起始位点,4.真核较原核有更多的起始因子（用 elf表示），而且相互作用更复杂,真核生物翻译起始复合物形成过程,43S前起始复合物,48S前起始复合物,80S翻译起始复合物,三、新生肽链通过核糖体循环而延长,肽链延长在核糖体上连续、循环式进行，称为核糖体循环(ribosomal cycle)，每循环一次肽链延长一个氨基酸残基，包括以下三步：进位(entrance)成肽(peptide bond formation)转位(translocation),延伸过程所需蛋白因子称为延长因子(e
16、longation factor,EF)。原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)EF-G真核生物：EF-1、EF-2,翻译起始复合物,A位：氨基酰位(aminoacyl site),P位：肽酰位(peptidyl site),目 录,又称注册(registration),指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核糖体A位。,目 录,（一）氨基酰-tRNA在EF-Tu-GTP协助下进入A位（即进位）,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,第二个氨基酰-tRNA在EF-Tu-GTP引导下进入核糖体的A位，伴随GTP水解、Tu-GDP脱离tRNA,而结合Ts和GTP，引导下
17、一个氨基酰-tRNA进位。,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,目 录,由肽基转移酶催化肽键形成,（二）P位氨基酰基/肽酰基与A位氨基酰-tRNA氨基形成肽键（即成肽）,（三）在延长因子EF-G和GTP参与下促进 核糖体沿mRNA移动/转位,在原核生物，转位依赖延长因子EF-G；在真核生物，则依赖GTP和EF-G的相应蛋白质EF-2。,fMet,fMet,目 录,（四）核糖体在肽链延长阶段有校读作用,核糖体的校读功能建立在正确的密码子与反密码子相互作用的基础上。,四、肽链合成终止阶段释放新生的肽链,肽链合成的终止包括终止密码的识别，肽链从肽酰-tRNA中释出，从核糖体分离出mRNA
18、和大、小亚基拆开。,终止过程需要的蛋白因子称为释放因子(release factor,RF),1.识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。2.帮助完成合成的多肽从P位点的tRNA释放。,释放因子的功能：,原核生物释放因子：RF-1、RF-2、RF-3 真核生物释放因子：eRF,原核生物肽链合成终止过程,RF,目 录,多聚核蛋白体(polysome)：mRNA与多个核糖体的聚合物,使蛋白质合成以高速度、高效率进行。,目 录,电镜下的多聚核糖体现象,目 录,翻译后的折叠和加工修饰Folding and PosttranslationalProcessing,
19、第三节,从核糖体释放出的新生多肽链不一定是具备生物活性的成熟蛋白质，必需经过各种翻译后修饰、加工过程才转变为有活性的成熟蛋白。,主要包括：,蛋白质折叠（protein folding）翻译后加工（post-translation processing）,一、新生肽链经历翻译后修饰,（一）肽链N端和C端的切除和/或化学修饰,细胞内的脱甲酰基酶或氨基肽酶可以去除N-甲酰基、N-末端蛋氨酸或N-末端的一段肽链。,在真核细胞，50%的蛋白质在翻译后，氨基末端的氨基发生乙酰化。,有些情况下，羧基末端的残基也可被酶切除。,（二）水解加工包括多蛋白水解加工和内含肽的剪接,1多蛋白水解加工可产生多种肽链,一些
20、蛋白质在合成之初是含有一系列头尾相连的蛋白质的长多肽链。多肽链的水解将裂解释放出各种蛋白质，释放出的蛋白质可能具有完全不同的功能，这些蛋白质称为多蛋白。,阿皮素原(POMC)的水解加工：,2内含肽切除导致外显肽连接,内含肽是蛋白质的内部片段，翻译后很快被剪切，两个外显肽连接到一起。内含肽的长度一般在300 600个氨基酸之间。剪接是由内含肽自我催化的。,1.个别氨基酸可进行甲基化和乙酰化修饰 2.蛋白质糖基化（glycosylation）修饰是一种 复杂的化学修饰 3.某些蛋白质加入异戊二烯基团4.结合蛋白质加入辅基5.大多数蛋白质有二硫键的形成,（三）氨基酸残基的化学修饰有多种形式,二、折叠
21、是肽链高级结构形成的过程,第一种模式认为是按等级进行的：新生肽链随着序列的不断延伸按等级逐步折叠，产生正确的二级结构、模序直至形成结构域和多肽链。第二种模式：多肽链通过非极性残基间疏水作用介导,自动折叠成“熔球（molten globule)”的紧密结构。细胞内大多数天然蛋白质折叠需要一些辅助性蛋白。,（一）多肽链通过分步反应快速地进行折叠,核糖体结合的分子伴侣：触发因子（trigger factor，TF）新生链相关复合物（nascent chain-associated complex，NAC）非核糖体结合的分子伴侣：70kD/40kD热休克蛋白（heat shock protein,Hs
22、p）家族 60kD/10kD热休克蛋白家族 蛋白质二硫键异构酶 肽酰脯氨酸异构酶,1分子伴侣有核糖体结合和非核糖体结合两类,（二）分子伴侣参与蛋白质折叠,细胞内分子伴侣完成以下功能：,封闭待折叠蛋白暴露的疏水区段；创建一个隔离的环境，蛋白质可互不干扰在此折叠；促进折叠和去聚合；遇到应激，使已折叠的蛋白质去折叠。,（1）热休克蛋白70(Hsp70)的两个主要功能域为折叠所必需,还需要辅助因子Hsp40和Grp E,非核糖体结合的分子伴侣,Hsp70反应循环,（2）大肠杆菌的Gro EL属于热休克蛋白60（Hsp60）家族,需要辅分子伴素10(cochaperonin 10)Gro ES的帮助,（
23、3）二硫键异构酶催化链内或链间二硫键形成,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要，这一过程主要在细胞内质网进行。,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可加速形成正确配对的二硫键，从而促进蛋白质折叠的全过程。,（4）脯氨酰顺-反异构酶催化顺反异构加速折叠,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象差别明显。,脯氨酰顺-反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,脯氨酰顺-反异构酶催化这种异构化的过程，可加速蛋白质的折叠。,2.目前对大肠杆菌的蛋白质折叠过程了解较多,（1）折叠过程首先经历Hsp70反应循环,（2）部分折叠的蛋白质尚需经历GroE
24、Gro ES 反应循环,三、亚单位聚合形成多亚基蛋白质,由一条以上肽链构成的蛋白质和带有辅基的结合蛋白质，肽链之间或多肽链与辅基之间需要聚合，方可成为活性蛋白质。,四、蛋白质合成后经靶向输送到细胞特异区间,新合成的蛋白质/多肽链须经分选、靶向输送到细胞特异区间或亚细胞器，在那里进行翻译后加工或发挥作用。,大肠杆菌新合成的多肽，一些仍停留在胞浆之中，一部分则被送到质膜、外膜或质膜与外膜之间的空隙。有的也可分泌到胞外。,真核细胞中新合成的多肽被送往溶酶体、线粒体、叶绿体、细胞核等亚细胞器。所以新合成的多肽的输送是有特异靶向的。,一部分核糖体以游离状态停留在胞质中，它们只合成供装配线粒体及叶绿体膜的
25、蛋白质。另一部分核糖体，受新合成多肽的N端上的信号肽（signal peptide）的控制而进入内质网，使原来表面平滑的内质网（smooth ER）变成有局部凸起的粗糙内质网（rough ER）。与内质网相结合的核糖体可合成3类主要的蛋白质溶酶体蛋白、分泌到胞外的蛋白和构成质膜骨架的蛋白。信号识别体(signal recognition particle,SRP)识别信号肽。,蛋白质生物合成与医学的关系Clinical Relatives in Protein Synthesis,第四节,一、病毒利用宿主蛋白质合成体系进行复制,某些病毒的翻译比宿主有效得多(例如Mengo病毒和大脑心肌炎病毒)。某些病毒mRNA比宿主细胞mRNA具更强的竞争优势。某些病毒还可阻止mRNA与40S核糖体结合，从而抑制宿主细胞的蛋白质合成。,二、许多抗生素通过抑制细菌蛋白质合成发挥作用,许多细菌感染的病理生理过程可能与破坏宿主的蛋白质合成有关；抑制或破坏细菌蛋白质的合成是许多抗生素(antibiotics)的作用机制。,嘌呤霉素作用示意图,四环素族,目 录,三、某些活性物质通过抑制细胞或病毒的蛋白质合成发挥作用,白喉毒素(diphtheria toxin)的作用机制:,白喉毒素,+,+,干扰素(interferon)的作用机制：,干扰素诱导eIF-2磷酸化而失活,干扰素诱导病毒RNA降解,
