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1、食用农产品微生物检验,为什么要进行微生物检验？食用农产品微生物检验的特点？主要食用农产品微生物检验指标?检测依据?检测结果？如何判断是否合格？不同样品采样方法？不同样品处理方法？,各类产品从原料、加工、储藏、运输、销售等各个环节，都会受到环境中微生物的污染，不同来源的微生物可通过各种途径污染暴露于环境中的各类产品，并在期中生长繁殖引起变质，影响产品的特性，甚至产生毒素、造成食物中毒、疾病传播等后果。因此，许多产品在生产、销售或使用之前必须对其进行微生物学检验。微生物学检验是产品卫生标准中一个重要内容，也是确保产品质量安全、防止致病菌污染和疾病传播的重要手段。,食用农产品与食品很难划定一个严格的
2、界线，但是由于其涵盖的对象不同，检测的侧重点差异很大。食品是经过一定加工的，因此其检测的侧重点是在加工过程中一些操作环节或是添加物品对食品安全带来的危害。食用农产品是指可用为食品或食品原料的农产品，是指通过种植、养殖、采集、捕捞形成的，未经加工或者经初级加工，可供人类食用的产品，包括各种植物、畜牧、渔业产品及其初级加工产品。主要包括粮食、油料、水果、蔬菜、畜禽肉、乳、蛋、食用菌、茶叶、蜂蜜等。目前，要求进行微生物检验的食用农产品主要包括肉、乳、蛋、水产、蜂蜜、茶叶等。,微生物常规检验内容与步骤,样品,感官观察,菌落总数,大肠菌群,病原菌检验,微生物检验的指标,菌落总数（个/1g、1cm、1cm
3、2)：清洁状态的标志；预测食品可能存放的期限.大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的指示菌.致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌 霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多
4、学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。,选择检验依据国内：国家、行业、地方、企业标准等国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等,本次任务,牛肉中细菌总数检验（4组）鲜鱼中霉菌、酵母菌检验（4组）请列出准备清单?请写出检验步骤?,检验前的准备,准备好所需的各种仪器。按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必培养基。做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌3060min.工作
5、衣、鞋、帽、等灭菌后备用。工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。,我的要求,熟悉微生物检验的基本程序和要求；掌握食品微生物检验中常见检样的制备技术；熟悉食品微生物检验中细菌总数、大肠菌群数、霉菌酵母菌的检验程序；熟悉掌握食品微生物检验中细菌总数、大肠菌群数、霉菌酵母菌检测的操作技术，并能获得正确的检验结果，写出规范的检验报告。,菌落总数的测定,平板菌落计数法 操作要点,将培养基置于45 恒温水浴锅中保温备用。编号:无菌试管（10-1、10-2、10-3、10-4。）、无菌培养皿、空白对照平板稀释菌液：摇匀平板：平板前后、左右或者以顺时针、逆时针。倒置培养,平板菌落计数法 注
6、意事项,检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。,霉菌、酵母菌计数,生肉样品的采取,屠宰场后的畜肉，可于开腔后，用无菌刀采取两腿内侧肌肉各150g（或劈半后采取两侧背最长肌肉各150g）；冷藏或销售的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位的肌肉2
7、50g。检样采取后放入无菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h。送检时应注意冷藏，不得加入任何防腐剂。检样送往化验室应立即检验或放置冰箱暂存。,生肉检样的处理,将检样进行表面消毒（在沸水内烫3s5s，或灼烧消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1：10稀释液。,水产样品的采取,水产检样的处理,固体样品的处理,捣碎均质法剪碎振摇法研磨法整粒振摇法胃蠕动均质法,1.捣碎均质法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r
8、/min均质12min即可。,2.剪碎振摇法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。,3.研磨法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。,4.整粒振摇法,直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。,微生物检测作业规范,各培养液配制完成后，杀菌前放入冰箱冷藏保存，但必须在48小时内对其
9、进行分装杀菌使用。已杀菌未开封的培养液在24小时内可直接使用；已杀菌未开封超过24小时或者已杀菌但开封而未用完的培养液都必须重新杀菌后使用。同一培养液反复杀菌不超过2次。杀菌时间由当班微检员用油笔直接写在瓶体。进入无菌间作业时必须做到：缓冲间、无菌间的紫外灯开启时间超过半小时；关闭紫外灯后，微检员把作业过程中将用到的所有物品放在缓冲间，同时在缓冲间更换专用的工作衣，同时佩戴口罩和卫生帽，然后再将物品转移到无菌间；作业时关闭紫外灯、空调、和无菌操作台风机；每次最多做4个样品。每次均做空白对比（除非有特殊说明）。完成作业后，立即做好相关标识、填写微生物检验培养登记表，然后清理无菌间。清理结束后，开
10、启紫外灯杀菌30分钟。,微生物检测作业规范,无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上最多只允许摆放以下物品：,食品卫生细菌学检验的目的，是要对食品进行细菌卫生评价。这就要求检验人员在求实的精神下，科学地进行被检对象的采样、样品送检、检样处理、检验以及报告。在整个过程中，不得掺杂检验人员的丝毫主观臆想和工作上的马虎，要有章可依地进行检验和报告。样品的采样送检样品的处理检验与报告,样品的采集,样品的种类,大样，就是一整批；中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；小样，也称检样，做分析用的，一般为25g。,采样的要求,1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代
11、表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。,微生物检验采样方法,采样原则：上能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.,1、液体样品采样方法,充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.,2、半固体样品采样方法,无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。,3、固体样品采样方法,大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品
12、；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。,4、冷冻食品采样方法,大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。,采样标签的填写,标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。,采样单 样品编号：产品名称（商品名）_规格型号_注册商标_生产厂家_通讯地址_邮政编码 受检地点_通讯地址_邮政编码 采样地点_采样日期_采样基数_生产日期_批号_产品依据标准_有效成分及含量_检验目地_检测项目_ 采
13、样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章）签字 签字 日期年月日 日期 年月日 备注,样品的送检要求,1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在15低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。,样品的处理方法,（一）液体样品（二）固体样品（三）冷冻样品,1.瓶装液体样品的处理,用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口
14、勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。,2.盒装或软塑料包装样品的处理,将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。,（二）固体样品的处理,捣碎均质法剪碎振摇法研磨法整粒振摇法胃蠕动均质法,（三）冷冻样品,冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超过18h，或在45 下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。,样品的检验,（一）、收样：1、收到样品后逐一核对验收，登记编号；如2004年收到的50号样品，编号可写成：20040050
15、2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。,检验,1、选择检验方法：国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等,2、检验要求,（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核 人应通知检测人更正，然后重新复核。（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写“检测报告底稿”。（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。,3、样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；（2）阳性样品：在发
16、出报告以后3天才能处理样品；（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。（4）微生物检验不进行复检,八、检验结果的报告,经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份。将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。,食品微生物检样的采集,样品种类样品可分大样、中样、小样三种。大样是指一整批样品；中样是指从样品各部分取得的混合样品，定型包装及散装食品均采样及散装食品均
17、采样250g；小样系指分析用的样品，又称为检样，检样一般为25g。采样的方法根据样品，如袋装、瓶装或罐装食品，应采用完整的未开封的样品；检样是冷冻食品，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱保存），非冷冻食品需在05中保存。（1）液体样品的采样：将样品充分混匀，无菌操作开启包装，用100ml无菌注射器抽取，放入无菌容器。（2）半固体样品的采样：无菌操作开启包装，用灭菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。（3）固体样品的采样：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位取样，应兼顾表面和深度，注意样品代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。样品是固体粉末，应边
18、取样边混合。,食品微生物检样的采集,（4）冷冻食品的采样：大包装小块冷冻食品的采样按小块个体采取；大块冷冻 食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冷冻上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。注：固体样品或冷冻食品取样还应注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。（5）生产工序监测采样车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌擦拭25cm2面积。车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于
19、车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检。,食品微生物检样的采集,采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日）取样注意事项：防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制；取样地点的环境控制，空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触；取样的操作要规范、迅速（无菌操作）；减少样品存放的时间（保持样本原有的状态、易变质的样本要冷藏）取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法,食品微生物检验的样品送检,采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物
20、的减少或增多。无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境中的微生物进一步污染；进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途遥远，可将不需冷冻的样品，保持在15 环境中送检，可采用冰桶等装置；若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0以下，或采用其他冷藏设备；送检样品不得加入任何防腐剂；水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。因此，采样后应在3h内送检，在送检途中一般都应加冰保存；对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊
21、要求的送检申请单。其内容包括：样品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度和湿度等,食品微生物检验的检验与报告,检验：检验样品送到实验室后，立即将样品置于普通冰箱或低温冰箱中，并进行登记、填写实验序号，按检样检样要求，积极准备条件进行检验。样品收集后应于36h内检验；报告：按样品项目完成各类检验后，检验人员应及时填写检验报告单，签名后送主管人员签字，加盖单位印章，以示生效，立即交食品卫生监督人员处理；实验室必须具有专用冰箱存放样品，对于一般阳性样品，在发出报告3天（特殊情况可适当延长）方可处理样品；进口食品的阳性样品，需保存6个月，才可处理；而对于阴性样品可及时处理。,食品卫
22、生微生物检验中常见检样的制备,肉与肉制品检样的制备乳与乳制品检样的制备蛋与蛋制品检样的制备水产品检样的制备饮料、冷冻饮品检样的制备调味料检样的制备糖果、糕点和蜜饯检样的制备酒类检样的制备方便面（速食米粉）检样的制备罐藏食品检样的制备,菌落总数的测定 测定方法,标准平板培养计数法（活菌计数法）显微镜直接计数法菌落总数快速检测纸片 电阻抗法测定食品中细菌总数,平板菌落计数法 菌落计数报告,平板菌落计数法 菌落总数记录报告,平板菌落计数法 注意事项,检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低
23、于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。,菌落总数的测定 其他菌落总数的测定,平板菌落计数法测定的是在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或兼性厌氧的菌落总数。厌氧菌、嗜冷菌、嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制。嗜冷菌计数（新鲜鱼贝）操作要点：采样后尽快冷藏检验；稀释液涂布于TS或CVT琼脂平板上，平板倒置于冰箱中冷藏培养。嗜热菌操作要点：采样煮沸5min（杀死细菌繁
24、殖体）；厌氧菌操作要点：稀释液与45硫乙醇酸钠琼脂混合摇匀，倒平板，在其上封一层3无菌琼脂。,一.食品微生物检验的一般步骤,样品采集,样品处理,样品保存,选择参考菌群,检验前的准备,菌落总数,大肠菌群,致病菌,分离培养,分离培养,增菌,纯化,染色镜检,生化试验,血清学试验,动物试验,结果报告,乳及乳制品的腐败变质,乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、极易吸收的钙和完全的维生素等。因此极易为微生物所腐败变质。鲜乳中污染微生物主要来源于乳房内的污染微生物和环境中的微生物。主要有乳酸细菌、胨化细菌、脂肪分解细菌、酪酸细菌、产气细菌、产碱细菌、以及酵母和霉菌。含水量合格的奶粉不适宜微生物
25、生长。但原料奶污染严重，加工又不当的奶粉中可能污染有沙门氏菌（Salmonella）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等病原菌。这些病原菌可能产生毒素而易引起中毒。,肉、鱼、蛋类的腐败变质,禽畜肉类的微生物污染，一是在宰杀过程中各个环节上的污染，二是病畜、病禽肉类所带有的各种病原菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、布鲁氏菌（Brucella）等。鱼类极易为水生微生物所引起腐败变质。假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、气单胞菌等，是新鲜鱼类的主要腐败菌。新鲜鱼类变质后组织疏松，无光泽，由于组织分解产生的吲哚、硫醇、氨、硫化氢、粪臭素等，而常有难闻恶臭。腌鱼由于
26、嗜盐细菌的生长而有橙色出现。鲜蛋也由于卵巢内污染、产蛋时污染和蛋壳污染而发生微生物性腐败变质。污染鲜蛋的微生物有禽病病原菌、其他腐生性细菌和霉菌等。它们使鲜蛋成为散黄蛋，并进一步分解产生硫化氢、氨、粪臭素等，蛋液成灰绿色，恶臭或粘附于蛋壳、蛋膜。,微生物检验的任务和内容,任务通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施提供科学依据。,内容检验的范围生产环境的检验原辅料的检验食品加工、储藏、销售环节的检验食品检验（重点）,菌落总数的测定 出现的实际工作问题,做菌落总数检测时,发现稀释倍数大的比稀释
27、倍数小的平皿上生长的菌落数还多,而且空白对照又没长菌,啥原因？,复习题,1、在微生物检验中，检验前要做好哪些准备工作？2、在微生物检验中，采样时要遵守哪些要求？3、在微生物检验中，样品的送检有哪些要求？4、在微生物检验中，如何进行样品的保留？,大肠菌群的测定 国标,2.大肠菌群指示作用 作为（判断食品是否被肠道致病菌所污染及污染程度的）指示菌的条件：和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出。在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。检验方法比较简便。大肠菌群在数量和检验方面均符合指示菌的三项要求，,六.致病菌检验参考菌群的选择,蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌,
