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1、青岛农业大学校级大学生创新创业训练计划项目中期检查报告学院食品科学与工程学院专业生物工程项目名称H2O2和H2对UV-B促进大豆芽菜中异黄酮富集的作用机制项目负责人王悦项目类别资助项目（J）/自筹项目（）一、项目进展情况及取得成果（按照项目研究工作计划逐一对照填写）项目进展情况（）按计划进行、（）进度提前、（）进度滞后主要研究阶段（起止时间）研究内容完成情况2021.3-2021.4根据国内外同类研究的最新发展动向，补充完善试验设计方案，准备实验材料已完成2021.4-2021.7完成UV-B胁迫下H2O2和H2处理对大豆芽菜生长状况和营养水平影响的研究已完成项目研究成果（已取得的成果）序号项
2、目成果名称成果形式1乩介导UV-B胁迫下乩。2诱导的异黄酮合成撰写SCI手稿二、项目中期报告一、项目执行的进展情况在项目的执行过程中，研究了H22和H2在UV-B促进大豆芽菜异黄酮积累中的信号转导作用，也就是UV-B胁迫对大豆芽菜内源H2O2和H2含量、异黄酮合成量、异黄酮合成的关键酶活性的影响，明确了UV-B促进H2O2和H2合成的途径，研究了H2对大豆芽菜异黄酮含量、异黄酮合成关键酶活性的影响，能够阐明H2O2对内源H2含量、氢化酶活性的影响及其两者协同作用的信号通路对大豆芽菜异黄酮积累的影响。1.1 H2处理对大豆发芽基本生理指标的影响由图1-1可知，在发芽2d时，外源H2处理对于大豆发
3、芽的芽长和鲜重影响较小。但在发芽4d时，对照组和UV-B辐照组的鲜重和芽长均随外源H2浓度的提高而升高。外源H2对于发芽大豆的影响存在剂量效应，在浓度为25%时最为显著，这可能是由于浓度过低时其作用小，过高时造成水中氧气浓度低，一定程度上又抑制了大豆生长”,这说明H2具有一定的缓解胁迫、促进发芽大豆生长的作用。0.24012.52550 I(X)心浓度H2 concentration (%)(E3-usq 6456484032 60.0.0.0. OnojdS/8) 1一。M qsay4.8012.52550100浓度H2 concentration (%)图1-1H2浓度处理对发芽大豆鲜重和
4、芽长的影响Fig.1-1EffectofdifferentconcentrationsofH?onthefreshweightandlengthofgerminatedsoybeans1.2 H?在UV-B辐照下累积异黄酮中的作用1.2.1 外源H2浓度对异黄酮含量的影响由图1-2可知，对照组及UV-B辐照组中，异黄酮含量均随外源H2浓度提高而增加，当H2浓度大于50%时，异黄酮含量逐渐稳定；同时，UV-B辐照下大豆发芽过程中异黄酮含量的累积，能够被发芽大豆内源H2合成抑制剂EDTA显著抑制，且存在浓度效应，随着EDTA的浓度增大，异黄酮含量逐渐减少(Mclbl) -CU-COU 012.52
5、550100为浓度H, concentration (%)(MaMZL) lu(luooBUOSI2000 012.52550100为浓度H, contentration (%)图1-2外源H?和EDTA浓度对异黄酮含量的影响Fig.5-2EffectofdifferentconcentrationsofH2andEDTAontheisoflavonecontent注：（八）外源H?处理；(B)UV-B辐照下外源H?处理；(C)EDTA溶液处理Note:（八）H2treatment;(B)H2treatmentunderUV-Bradiation;(C)EDTAtreatment那么在研究中，
6、可以发现氢气(H2)作为一种选择性的抗氧化剂和信号分子受到广泛关注。H2是植物体内的生物活性物质，不仅能够调控植物根的形态建立，还能提高植物应对非生物胁迫如干旱、盐害及重金属胁迫等的耐性。经过研究发现异黄酮富集过程中的信号分子不仅有助于揭示逆境胁迫下异黄酮合成过程中的信号传递规律，而且能够更大程度的定向富集异黄酮昔元这一功能性成分。通常植物在逆境胁迫下，通过调节基因的表达量，细胞产生快速感应，进而使相关酶的活性发生变化。据研究表明，UV-B照射造成一系列生理变化的同时，部分异黄酮甘元合成限速酶的基因表达上调。也有研究表明，H2HO-途径关键酶基因HerI能被紫外照射等许多因素诱导上调。发芽大豆
7、在感受并适应UV-B胁迫过程中，异黄酮甘元等抗逆物质的含量显著增加，这些变化通常是在细胞感受环境胁迫后，促进胞内与抗逆相关的蛋白翻译，改变生理生化活性，从而适应胁迫环境。应用高通量的蛋白质分离与鉴定技术如iTRAQ蛋白质组学技术，研究蛋白表达模式的变化，并通过WeSternBlot技术对特定代谢通路的蛋白表达差异进行进一步验证，不仅仅是从蛋白质角度进一步佐证相关研究结果，更能阐明细胞代谢、信号传导和分子水平的关系。二、项目执行取得的成果对于实验中的原材料大豆，大家并不陌生。大豆的食用方式很多，它可以做成豆腐，磨成豆粉亦可以做成豆酱等等。同时大豆中含有很多营养成分，如大豆异黄酮、氨基酸、维生素C
8、等，因此它具有抗氧化、抗肥胖等有益作用；大豆异黄酮具有延缓衰老、降低胆固醇、降低心血管疾病发病率等优点。因其优点多多已成为消费者的热门选择。大豆的食用方式之一就是将大豆进行发芽，豆芽也成为人们日常饮食重要的一部分。发芽过程会使大豆种子发生各种生化变化，会诱导初级和次级代谢产物的积累。发芽可以提高大豆的营养价值，且是一种比较绿色的方法。近年来，UV-B胁迫H2O2和H2技术主要应用于对食品的包装或者对食品表面进行消毒和微生物的去污，微生物去污的领域主要包括水果蔬菜、肉类、谷物等。除了消毒去污，UV-B胁迫技术还应用于研究其对大豆及各种豆类生长发芽的影响。此外，在实际应用和研究上，UV-B胁迫具有
9、无毒性残留物、低能耗、设备简单、非温度操作条件等优点。本项目通过研究UV-B胁迫下H2O2和H2的处理对发芽大豆芽长、鲜重干重、营养性成分、功能性成分和抗氧化活性的影响。结果表明，UV-B胁迫处理能促进豆芽生长，但过度处理则会抑制豆芽的生长；发芽过程中总糖从51.4mgg降到了23.9mgg,游离氨基酸从2.69gIOog降低至U1.49gIOog再增力口至j2.83g/100g。此外，UV-B胁迫下处理显著提高了豆芽中异黄酮(从7527.74到9228.31gg)的含量。UV-B胁迫处理后豆芽的抗氧化能力增强表明，维生素C和酚酸的变化与抗氧化活性高度相关。因此，发芽过程中的UV-B胁迫处理是
10、提高大豆营养和功能品质的有效方法。三、研究结果与讨论3.1 生理参数指标3.1.1 芽长图显示了UV-B胁迫处理时间对大豆生长的影响。UV-B胁迫处理会使芽长增加，芽的长度能从不经UV-B胁迫处理的对照的10.5Cm增长到25.5cm左右;然而随着UV-B胁迫处理时间的继续延长，芽长缩短，甚至低于对照组。UV-B胁迫处理对芽长有促进作用的结论同样得到了证实。UV-B胁迫处理能增长芽长的原因可能在于UV-B胁迫处理后会产生促进植株生长的氧化物；而抑制芽生长的原因可能是UV-B胁迫处理时间过长，pH值较低，酸性较大，不利于植株生长。3.1.2 鲜重与干重。优$ . IIIIIIrccoml 102
11、1h KteI2O IMhtrcflmcM Hlne Qltt . JIIIIjBccfnrolTl(T30TJOHKJT2T3treatment如图是UV-B胁迫处理对大豆芽鲜重和干重的影响。可见豆芽的鲜重也是呈现先增加后减少的趋势，在UV-B胁迫处理60s时鲜重最大，随后降低，这与芽的生长趋势一致，也就是说芽生长的越好，单株豆芽的鲜重也就越大。即鲜重有此变化的原因有可能是芽生长趋势引起的。同样，干重的趋势与芽长、鲜重的整体趋势一样，UV-B胁迫处理60s之前一直处于增长状态，而UV-B胁迫处理超过60s后豆芽的干重急剧下降，这可能是由氧化胁迫引起的。3.2总糖含量（八）(B)图LUV-B胁
12、迫处理后发芽大豆中的总糖含量。UV-B胁迫处理干大豆（八）UV-B胁迫处理干大豆和水（B）经UV-B胁迫的不同处理方式后发芽大豆的总糖含量如图1所示。从整体来看，不管是用UV-B胁迫只处理干大豆还是既处理干大豆同时也处理水，与空白相比，发芽大豆的总糖含量是降低的，并随着UV-B胁迫处理时间的延长总糖含量不断下降。总糖含量降低的非常明显，从51.4mgg降到了23.9mgg糖类的降解其实是一个为蛋白质合成提供所需能量的过程，通过实验得出了超声处理大豆也会降低总糖含量的结论。这些结果均表明发芽能消耗总糖，UV-B胁迫处理可能会加速总糖的消耗速度，同时UV-B胁迫处理对大豆芽的营养成分有有利的影响。
13、在实验过程中，UV-B胁迫处理会促进大豆的生长，而UV-B胁迫过度处理则会抑制大豆的生长。同时，豆芽中的异黄酮含量与UV-B胁迫处理时间有关，随着UV-B胁迫处理时间的增长，异黄酮含量升高，但随着过量处理不仅含量不会进一步增加甚至还会减少。此外，在UV-B胁迫处理下，发芽大豆的营养性成分、功能性成分和抗氧化活性明显高于没有经过UV-B胁迫处理的大豆；并且UV-B胁迫具有设备简单、能耗低、无毒性残留物等优点。因此,UV-B胁迫处理下进行发芽是一种较好、较简单的发芽方式，且此处理下的发芽大豆是一种绿色、易生长的营养和功能性成分来源。三、经费使用明细情况项目获批总经费：3000元已使用项目研究经费：
14、3000元已报销金额：3000元未报销金额：0元项目经费开支情况名目用途金额备注论文版面费论文出版2000专利申请费调研、差旅费打印、复印费资料费试剂等耗材费化学试剂、生化试剂、标准品；实验原辅料及易耗品1000元器件、软硬件测试、小型硬件购置费其它四、项目后期具体工作计划项目后期将继续开展UV-B胁迫下H2O2和H2对大豆芽菜中异黄酮合成量、异黄酮合成的关键酶活性的影响，优化浓度工艺条件；研究H22和H2间相互介导作用，阐明H22和H2的相互关系对大豆芽菜异黄酮积累的影响。此外，还要继续研窕H2O2-H2对大豆芽菜ABA含量、ABA合成酶活性的影响，并且阐明H2O2-H2-ABA的信号通路对
15、大豆芽菜异黄酮积累的影响。同时，还要继续研究UV-B胁迫下H2O2-H2对大豆芽菜内源NO含量、NO合成酶活性、异黄酮合成量、异黄酮合成的关键酶活性的影响，明确H2O2-H2-NO信号通路中对异黄酮富集的作用；研究H2O2对大豆芽菜MeJA含量、MeJA合成酶活性的影响，阐明H2O2-H2-MeJA的信号通路对大豆芽菜异黄酮积累的影响。五、指导教师意见：（包括项目的组织实施、进度、预期效果、经费使用等情况）该项目在按照项目申报书计划时间进行，研究了H2O2和H2在UV-B促进大豆芽菜异黄酮积累中的信号转导作用，也就是UV-B胁迫对大豆芽菜内源H2O2和H2含量、异黄酮合成量、异黄酮合成的关键酶活性的影响，并达到了相应的预期成果，在经费使用上能够按照项目的实施计划合理使用指导教师签字：马萌2021年9月15日六、学院审核意见：学院盖章年月日中期检查结果类别（请在对应结果中打“V”）通过限期整改不合格七、学校审核意见：学校盖章年月日上传成果附件:附件2.docx
