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1、生物化学实验设计过程生物化学分析方法主要生物物质分析（含量和活性测定）实验材料的选择与处理目的物的提取与分离生物物质的浓缩、干燥、保存及纯度鉴定,第二章：生物化学分析的常规方法,生物化学实验的化学过程生物化学实验的物理过程实验方法的组合,一、生物化学实验设计过程,1、实验的化学过程,几个要求,分离试剂,与目的物不发生化学反应或相互作用，不改变其属性，保存分子的原独立状态。,易使目的物发生存在状态的变化（溶解度、分配系数等）。,不易残留，易回收处理，对人体和环境不易造成损害。,几个要求,对试剂选择总的要求：1.满足对目的物最大限度的溶解和分离要求，对于鉴定试剂要越纯越好，灵敏度和转移越高越好。2
2、.用于起相同或相近作用的试剂要选择成本低、用量少的试剂。3.所选择的试剂只能促进目的物向实验目的方向转移，而尽量不产生副反应。,2、实验的物理过程,（1）物理过程的特点,目的物状态的转变只受物理因素（温度、压力、黏度、溶剂介电常数等）的制约,（2）物理过程所需设备的选择,选择原则：尽量选择工作效率高、精确度大、分辨率好的设施和器具。,关键：大量收集资料进行方法上的分析、比较，全面了解各方法的优缺点及使用条件等，形成自己的实验方案，然后再行选择。,3、实验方法的组合,实验方法的组合的目的：构成一个实验流程的工作路线，避免盲目。要明确：做什么？用什么材料做？涉及的器具和设施有哪些？工作量有多大？关
3、键工作是什么？难点是什么等？,生物化学实验过程的设计,1、对分离制备性实验，尽量做到目的物回收率、纯度、活性均较高；2、整个过程参与环节的组合越紧凑越好，活性和目的物流失越少越好；3、设备和试剂的选择要根据目的物的要求确定用量以减少消耗；4、整个流程要有可操作性，同一操作方法，尽量避免重复使用。,二、生物化学分析方法,重量法化学法分光光度法（比色分析法）酶法色谱法,生物化学分析的目的：测定一定供试样本中某类或某种生化物质的含量或活性。,1.重量法,重量法：通过一定的方法和程序，从供试样本中提取、纯化出某一类或某一种成分，求出其在样本中所占比例的分析法。,常用重量法分析的生物物质：水分、灰分、粗
4、脂肪、纤维素等。,例：油料作物种子粗脂肪的含量的测定 选取具代表性的种子，去杂质，按四分法缩减取样。然后按国家标准（GB）制样、取样、抽提、干燥、称重、计算含量。,2.化学法,化学法：根据物质间的化学反应，按照等物质量规则建立的分析方法。如酸碱滴定法、氧化还原滴定法、络合滴定法等。,常用化学法分析的生物质：蛋白质（粗蛋白）含量、维生素C含量和某些酶活性测定等。,3.分光光度法,分光光度法：是利用物质所特有的吸收光谱来测定其含量的一项技术，其基本依据是朗伯-比尔定律。,分光光度法是生化分析中最常采用的技术（灵敏度高、操作简便、精确、快速，对于复杂的组分系统，不需分离即可检测出其中所含的微量组分）
5、，涉及各种生物物质的分析及酶活性的测定。,紫外 可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法。,4.酶法,酶法分析的优点：选择性强，不受体系中共存物质的干扰；灵敏度高，可测10-10g的微量物质。,5.色谱法,色谱法的主要作用：是实现混合物中各组分的有效分离，完成定性、定量分析。纸色谱、薄层色谱、薄膜色谱等通常用于定性分析；而高效液相、气相等色谱则可做到短时间准确完成生化物质的分离和定量分析。,三、主要生物物质分析,水分测定碳水化合物分析脂类物质分析蛋白质分析核酸分析矿物质分析维生素分析,1.水分测定（生化分析的基础）,常用水分测定方法：
6、加热干燥法,各种研究中不同物质分析结果的比较，利用实验材料的长期保存。,适用于受高温易变化的材料。条件：真空干燥箱（5-100mmHg、40-100）,适用于相对耐高温材料。条件：普通干燥箱。干燥一般过程：新鲜材料杀青（105 20min），然后80 烘至恒重（每次2h）。,快速水分测定仪,含水量的表示方法,含水量（占鲜重%）=（鲜重-干重）/鲜重100,鲜重法,最常用的方法,水分测定注意事项：测定样品少量，但需具有代表性必须考虑所测材料的热稳定性，如油料种子只能在40-70 下烘干。每次烘干后需加盖放入干燥器中冷却（一般需30min）后才能称重。烘箱内一次放入的样品不能过多，箱体边角和下层不
7、能放置样品。干燥器下层放置未失效的干燥剂，干燥剂应占底部容积的1/3-1/2。,2.碳水化合物分析,碳水化合物（糖类物质）,碳水化合物,单糖双糖多糖,有效碳水化合物：单糖、低聚糖、糊精、淀粉、糖原等。无效碳水化合物：果胶、半纤维素、纤维素、木质素等。,总碳水化合物=100-（水分+粗蛋白+粗脂肪+粗灰分）%,可溶性糖:还原性单糖、双糖和非还原性双糖、寡糖。不溶性糖：淀粉、果胶、半纤维素、纤维素、多缩戊糖等。,碳水化合物的定性定量分析方法,最常用的方法，并以还原糖测定方法为主。非还原糖和多糖等的测定是将其水解转化成还原糖进行测定，并以还原糖来表示其含量的。,定性定量的依据：糖分子中的四种结构特征
8、。含有的自由醛基和酮基的还原性；分子中醇醛缩水成糠醛或甲基糠醛与萘的成色反应；：邻位的醛、醇成脎后做熔点分析和结晶体分析；糖醇羟基的甲基酯化后进行气相色谱分析（组分分析）。,可溶性糖定量测定的常用方法,适用于水果、蔬菜等样品。样品为糊状或粉状。提取条件:70-80水浴加热1h.,适用于含淀粉和葡聚糖较多的样品。样品用80%乙醇回流提取3次，每次30min，提取液合并，蒸去乙醇，蒸馏水定容。,（2）还原糖的测定,3.5-二硝基水杨酸比色法（DNS比色法）,该法属半微量定糖法，所测结果反应的是样品中各种还原糖的总量。优点：操作简便、快速、杂质干扰少，尤其适合批量测定。,测定浓度范围：大于50ng/
9、ml,小于3.0mg/ml（样品光吸收值不能超过0.8）;比色波长540nm；标准曲线（需过原点）所得结果一元回归后其方程中的相关系数0.96，每次（每批）测定均制作标准曲线。,注意事项：,Somogyi-Nelson比色法（砷钼酸比色法）,优点：重复性较好、产物稳定，测定范围：10-180g/ml；测定波长560nm,兰-埃农法（lan-Eynon）姆松-华尔格法（Munson-Walker）,国际食糖分析方法统一委员会于1964年确定的还原糖标准分析方法。优点：准确性高、重现性好。,常量法；为斐林式滴定法的改进方法,（3）可溶性总糖的经典测定方法,原理：可溶性糖（单糖、寡糖、多糖）与强酸共
10、热生成糠醛衍生物，后者与显色剂缩合成有色络合物，便可进行比色测定。,优点：简单、迅速、灵敏，颜色持久缺点：所用试剂腐蚀性强，有色样品结果偏高，不理想。,优点：简单、迅速、灵敏。缺点：蒽酮试剂需当日配用；色氨酸含量高的蛋白质对显色反应有干扰；实验操作要求较高。,该法操作简单，主要用于糖蛋白中总糖的测定。缺点：氨基糖的存在可导致颜色降低、色氨酸也可导致误差。,组分分析：薄层层析法、高效液相色谱法。,淀粉的测定,粗纤维的测定,目前广泛采用的方法（粗纤维测定仪）,脂类,单纯脂类,复合脂类,非皂化脂类,酰基甘油酯,蜡,磷脂,糖脂、硫脂,萜 类,甾醇类,含有脂肪酸,不含脂肪酸,3.脂类物质分析,最常用的方
11、法，一般采用非极性溶剂（乙醚、氯仿、苯等）提取非极性疏水结合的脂质。,根据溶解度差异进行的分离提取。如卵磷脂易溶于乙醇而不溶于丙酮，脑磷脂易溶于乙醚而不溶于乙醇和丙酮,主要用于可进行皂化的甘油三脂和高级脂肪酸的提取,主要用于从油料种子，采用105-106Pa的压力，将流动性较大的油挤压出来（毛油）,分离混合脂最有效的方法。常用吸附层析、离子交换层析等。,简单、快速、灵敏的方法，是分离复杂脂质的好方法。,常用于甘油三脂组分、磷脂组分、生育酚组分、脂肪酸组分、甾醇组分等的分析。,脂质分析研究中广泛应用的技术。主要用于脂肪酸、甘油三脂、生育酚、甾醇等的分析,与质谱连用鉴定组成成分,4.蛋白质分析,总
12、蛋白（粗蛋白）分析：凯氏定氮法（微量、半微量、常量法）,总蛋白（粗蛋白分析）,可溶性蛋白分析,过程：消化、蒸馏、滴定、含量计算（蛋白质系数：6.26）,蛋白质组成分析（氨基酸自动分析仪）,加热植物样品+H2SO4 催化剂(NH4)2SO4+H3PO4+CO2+SO2+SO3(NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 NH3+4H3BO3 NH4HB4O7+5H2O NH4HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO3,消化,蒸馏,滴定,消化炉及消化过程,半自动定氮仪：蒸馏过程手控自动进行,全自动定氮仪：蒸馏、滴定、计算同时自动完成。,可溶性蛋白质含量的测定方法,含
13、量测定方法,双缩脲法,考马斯亮蓝（Bradford）法,Folin-酚（Lowry）法,二喹啉甲酸（BCA）法,紫外吸收法,氨基酸分析法,灵敏度范围：0.5-10mg/ml。快速、蛋白质特异性影响小；准确度较差。,灵敏度范围：。灵敏度和准确度均高；繁琐、专一性差、干扰物质多。,灵敏度范围：。灵敏度和准确度高，干扰物质少；环境影响大、操作要求高。,灵敏度范围：。快速、简便、灵敏度高、稳定性好、干扰物质少；不同蛋白质测定时有较大偏差。,灵敏度范围：0.2-2mg/ml。简便、快速、灵敏、不消耗样品；准确度较差，干扰物质多。,最接近真实蛋白质含量的测定方法。准确度最高；操作和设备要求较高，测得的蛋白
14、质含量较真实值略偏低。,5.核酸分析（核酸含量测定）,核酸含量的测定,紫外吸收法,二苯胺法（DNA）,地衣酚法（RNA）,定磷法,植物材料中DNA的提取：CTAB法,动物材料中DNA的提取：氯仿异戊醇法,灰分测定：重量法,主要步骤：样品称重碳化灰化恒重含量计算,矿质元素测定（定性定量分析）,主要过程：样品消化酸化测定,8种元素（Ca、Fe、K、Mg、Mn、P、Zn、B）可实现定量，18种元素实现半定量。,酶的提取及活性测定：,酶在提取时通常使用缓冲液提取并需加入保护剂和稳定剂。,酶活性测定方法：多种，常用比色法（试剂盒的应用）。,维生素测定方法：比色法、滴定法、仪器法等,生物大分子活性物质的存
15、在方式和存在特点实验材料的选择和要求材料的预处理生物组织与细胞的破碎,四、实验材料的选择及预处理,1、生物大分子活性物质的存在方式及存在特点,（1）存在部位和分布方式：存在部位一般与生物学功能相关，分布方式则一般被分为“胞内”和“胞外”。,（2）存在的特点：生物活性物质在生物材料中含量较低，且生理活性越高的成分，含量往往越低。生物材料中的生化组成数量大、种类多，目的物与众多杂质理化性质十分接近，所以分离、纯化比较困难。生物大分子活性物质的结构和理化性质不同，所以分离纯化方法不同，不可能有统一的标准方法。,生物大分子分离纯化的一般步骤,沉淀技术离心技术膜分离技术等,前处理粗分级 细分级 浓缩干燥
16、,材料选择与处理细胞破碎及目的物的提取（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）,原料的选择和预处理生物组织与细胞的破碎从生物材料中提取有效的活性物质有效成分的分离纯化后处理及制剂,离心技术电泳技术层析技术等,化学法物理法,2、生物材料的选择和预处理,生物材料的选择主要考虑：来源，价格，目的物含量，杂质的种类、数量和性质等。,一般选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。,材料选择基本原则：有效成分含量高，来源丰富易得，材料新鲜，目的物易与非目的物分离，所取样品具有
17、均匀性和代表性。,（1）材料的选择,（2）材料采集、保存和预处理,材料采集：要求新鲜、快速、完整、尽量不带入其他组织，符合卫生条件，无微生物污染和有害物质等。,材料保存方法：速冻、冻干、有机溶剂脱水、制成“丙酮粉”、快速干燥等。,预处理,动物材料:去结缔组织、脂肪组织等。,植物材料:清洗、去壳、杀青等。,微生物材料:固液分离等,动物样品预处理：清洗去结缔组织、脂肪组织等绞碎、匀浆脱脂冷冻处理（液氮或超低温保存）。,植物样品预处理：,制备“丙酮粉”,种子样品的处理：去杂质研磨或粉碎过筛（80-100目）混 匀保存（长期保存需蜡封并放入少量樟脑或二氯甲苯等）。,根、茎、叶、果实样品的处理：干样制备
18、：净化杀青（105，15-20min）烘干（70-80，8-12h）或凤干粉碎过筛混匀保存。鲜样：用于酶活性测定，某些化学成分含量测定的等。,及时测定；液氮或超低温保存；冷冻干燥后于0-4 保存；匀浆后样品可加防腐剂（甲苯、苯甲酸等）于0-4 保存或超低温保存。,微生物样品预处理：主要是固液分离。最常采用的方法为离心和过滤。液体部分可在低温下短时间保存，固体则可制成冻干粉于0-4 长期保存。,3、生物组织与细胞的破碎,细胞破碎率测定方法:1.直接测定破碎前后细胞数。2.测定电导率。3.测定释放的蛋白质量或酶活力。,一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由
19、于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。,五、目的物的提取与分离,1、目的物的提取,提取（抽提或萃取）：利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程。,物质的性质与提取方法的选择,一般规律：相似相溶；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性易溶于碱性溶剂；温度高，溶解度大；大分子蛋白质、酶、活性肽等远离其等电点PH
20、时，溶解度增加。操作时为尽量多的获得目的物一般采取多次提取，溶剂用量常为材料的25倍。,活性物质的保护措施采用缓冲系统：磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、醋酸、硼酸等缓冲液，一般要求浓度较低，以增加目的物的溶解性能。添加保护剂：半胱氨酸、巯基乙醇、金属螯合剂等。抑制水解酶的作用：EDTA、SDS、DFP(二异丙基氟磷酸)、蛋白酶K等。其他保护措施：防紫外线、剧烈搅拌、过酸过碱、高濒振荡等。,温度：对耐热生化成分如多糖类，可用浸煮法（5090）；不耐热生物活性物质一般在010 提取。溶剂为有机试剂时必须在较低温度下进行提取。酸碱度：pH值一般控制在49范围内，同时避免在目的物等电点附近进行提取。多糖类
21、物质因在碱中稳定，多用碱性溶剂系统提取。提取液浓度：,2、影响提取的因素,提取时间,2、目的物的分离,生物大分子分离纯化技术包括：生物大分子的分离分析和生物大分子的制备。,（1）分离纯化原理：,根据分子性状和大小不同进行分离（差速离心、超离心，膜分离，凝胶过滤等）。根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离（电泳法，离子交换法，等点聚焦法等）。根据分子极性大小及溶解度不同进行分离（盐析法，分配层析法，逆流分配法，等点及有机溶剂沉淀法等）。根据物质吸附性质不同进行分离（吸附层析法等）。根据配体特异性进行分离（亲和层析法）,六、生物物质的浓缩、干燥、保存及纯度测定,1、生物的浓缩方法,沉淀法（盐析与有机溶剂沉淀）,葡聚糖凝胶浓缩法（Sephadex G-25）(1:5),聚乙二醇浓缩法（大于20KDa）,超滤浓缩法,常压蒸发法,真空减压浓缩与薄膜浓缩法,2.生物物质的干燥,3.生物物质的保存,干粉保存,液态保存,制品较稳定，活性可保持数月至数年，储存方法简单（置干燥器中密封于0-4下保存即可）,不稳定，保存时间不宜过长，需做防腐或稳定性保护。大多数生物活性液态保存时可在0-4下进行。,
