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1、响应面法优化蛋白酶生产工艺（下）,实验内容,1、干物质失重的测定2、蛋白酶活力的测定3、数据分析与建模4、响应曲面作图5、整改方案分析,一、干物质失重的测定,干重失重发酵前干重发酵后干重,二、蛋白酶活力分析,1、原理,（1）、福林试剂在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还原而呈蓝色反应。（2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)。（3）、以酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计测定。（4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水
2、解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。,2 试剂,1 福林试剂 于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO42H2O)100g，钼酸钠(NaMoO42H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至1000ml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。,2、0.4mol/L
3、三氯醋酸(TCA)溶液 称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。3、0.4mol/L碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容至1000m1。4、0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液 A液：称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。B液：称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液。,5、2%酪蛋白溶液 称取干酪素2g加入0.1mol/L氢氧化钠20ml在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至1000ml即成
4、。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加12滴酒精消泡。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸23滴湿润。,6、100g/m1酪氨酸溶液 精确称取在l05烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为1000g/m1。再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成100g/m1酪氨酸镕液 此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。,3 操作步骤,3.1 标准曲线的绘制,（1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液,(2)测定步骤 另取6支试管
5、按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。摇匀置于水浴锅中，40保温发色20min，在波长660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值 以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。,准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g，用1020ml蒸馏水，30浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定倍数(使其测定光密度在0.20.4范围内为宜)。,3.2 酶液的制备,取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管，置入40水浴中预热35min。在三支平行试验管中分别加入1ml 2%酪蛋白溶液，准确计时保温10mi
6、n。立即加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。分别吸取1ml清液，加5ml 0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40水浴中显色20min。空白管中先加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，再加l ml 2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。以空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。,3.3 测定,蛋白酶活力单位定义：在40，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。,式中：K：标准曲线中OD值为1所相当的酪氨酸的微克数；OD：平行试验管的平均光密度；4：试管中反应液总体积(毫升)；10：反应10分钟；N：稀释倍数；W：曲的称取量(克),4 计算,（1）对于同一台分光光度计与同一批福林-酚试剂，其工作曲线K值可以沿用，当另配福林-酚试剂时，工作曲线应重作。（2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。,5 说明,三、数据分析与建模,使用DESIGN EXPERT 7.1 软件1、建立数学模型2、模型显著性检验3、解方程，求出最佳发酵条件4、求出模型所预测的最高产量。,四、响应曲面作图,作出本次实验的2D与3D曲面图。,五、整改方案分析,分析本次实验设计存在的问题，如何改进实验设计？,
