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1、第五章 毛细管电泳法High performance capillary electrophoresis,毛细管电泳的基本概念及主要应用,毛细管电泳,毛细管电泳 指一系列以内径10 200m的毛细管柱为分离通道，以高压直流电为分离动力对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称 毛细管电泳和传统电泳的区别 传统的电泳是在平板凝胶的两端加上一定的电压使组分分离 毛细管电泳是在散热效率极高的毛细管内进行，它可以加上 0 30 KV 的高电压进行分离，达到快速、高效,毛细管电泳的特点,毛细管的特点 容积小，以100长、75m内径的毛细管计，容积仅为4.4 l 侧面/截面积比大，使毛细管散热快
2、，能承受100 1000V/cm的高电场 能使用自由溶液、凝胶等作为支持介质 在溶液介质下能产生平面形状的电渗流,毛细管电泳的特点(续）,毛细管电泳的特点 高效：区带电泳中，柱效一般为几十万几百万理论塔扳/米 快速：多数分析在10分钟内完成，有的可以在60秒内完成 高灵敏度：紫外检测器 10-1310-15mol 荧光检测器 10-1910-21mol 微量：进样量 110 nL 样品量 5ul5 mL 检测:在线检测,毛细管电泳的特点（续）,重现性:迁移时间 0.5%经济：实验消耗不过几ml缓冲液，没有泵输送系统 样品对象广：从无机离子到整个细胞，具有包罗“万能”的分析功能和潜力 自动：CE
3、是目前自动化程度最高的分离方法 自动进样，缓冲液交换，数据处理 洁净：,毛细管电泳与平板凝胶电泳的比较,毛细管电泳与HPLC的比较,相同之处：1.快速高效分离技术2.可定量3.全自动化4.可用不同模式5.在许多领域逐步取代HPLC,毛细管电泳与HPLC的比较,毛细管电泳的主要应用,手性化合物 碱性药物分子 法医毒物/临床毒理 蛋白质/多肽/氨基酸 糖类/糖蛋白 核酸/核苷酸 无机及有机离子/有机酸 其它小分子 水溶液中分子间的相互作用 单细胞分析 药物与细胞的相互作用,分析与微量制备,手性/异构体拆分,方法简单化 改善分辨率 快速 成本降低 方法开发过程简单,碱性药物分析19种混合碱性药物的质
4、量控制分析,在其它药物分析中的应用,主成分的定量测定 痕量杂质检测 中药材成分分析/指纹图谱 中药复方制剂中化学成分测定 药物计量离子配比测定 药物代谢产物测定 药物与蛋白质的相互作用研究 滥用药物测定 药厂质控,在蛋白质和多肽分析中的应用,肽、蛋白和糖蛋白的鉴别 结构分析 纯度检测 非均一性、多样性研究 稳定性研究 结合和动力学研究 定量测定 等电点测定 蛋白质和多肽的质量控制 微量制备,在糖类/糖蛋白中的应用,多糖谱图的制定 水化合物分离及测定 蛋白分析 构体分析 糖脂研究,在核酸/核苷酸分析中的应用,核酸、基因疫苗的质量控制 碱基、核苷和核苷酸的分析 纯度检测、片段收集和微量制备 PCR
5、产物分析和dsDNA分析 蛋白质-DNA相互作用测定 基因突变测定 基因表达测定 DNA序列测定(CEQ2000XL),在临床医学中的应用,临床疾病诊断 临床蛋白分析 基因诊断 病毒检测 临床药物检测 药物代谢研究 临床分子生物学测定 毒物、滥用药物测定,CE/MS/MS联用技术及应用,药物的结构 药物及其代谢产物分析 蛋白质和多肽结构 蛋白质酶解产物测定 核苷酸、DNA结构 其它领域的应用,在其它工业领域中的应用,药品纯度及杂质检测 石油化工产品杂质监测 食品中有机酸检测及矿物质分析 环境污染物分析 金属阴和阳离子、无机离子检测 烟草中成分检测 纺织染料的测定 表面活性剂测定,毛细管电泳存在
6、问题,使用了小管径的毛细管，制备能力差 光路短，要用高灵敏度的检测器检测样品 凝胶、色谱填充管要用专门的灌制技术 大的侧面/截面积比会“放大”吸附的作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰 吸附会引起电渗的变化，进而影响分离重现性,毛细管电泳与HPLC的互补结合应用,逐步代替许多HPLC 的功能 手性拆分、蛋白质分析、碱性药物、DNA分析、毛细管电泳中药指纹图谱、药物的质量控制、杂质测定 在制备功能上是互补的：HPLC 强调较大的制备量 CE 强调可获得极高的纯度,基本理论,分离原理,高效毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按淌度或/和分配系数不同进行高效,快速分离的一种电泳新技
7、术,例：以应用最多的毛细管区带电泳（CZE）为例,在移动过程中，由于样品组分间的淌度不同，它们的迁移速度不同，所以经过一定时间后，各组分就按其速度或淌度的大小顺序，依次到达检测器检测窗口被检出，这样就可以得到按时间荷响应值（A）分布的电泳谱图,分离原理,毛细管和电泳槽中充有相同组分和相同浓度的背景电介质溶液，样品从毛细管的进样端导入。当毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝着与其电荷极性相反的电极方向移动。,毛细管电泳预备知识,偶电层和Zeta电势 偶电层是浸没在液体中的所有表面都具备的一种特性，通常是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面电荷异号的离子层 按照近代偶电
8、层模型，在偶电层溶液一侧由两层组成：第一层：吸附层，又称为斯特恩（Stern）层或 紧密层（Compact layer）第二层：扩散层diffuse layer,0为表面电势，它在stern层中线性地降到d，它是stern面和溶液内部的电势差，和特性吸附离子的性质和数量有关。在stern面外侧很近的地方有一剪切面，是紧贴在固相表面粘度迅速变化的区域，我们把剪切面上的电势称为zeta（）电势，其值略低于d，公式计 式中：e溶液中每单位面积总 的过剩电荷 介质的介电常数-扩散层的厚度，它和电 介质浓度（C）有关，确切地说，和溶液的离子 强度有关,毛细管电泳中的zeta电势,第一种：毛细管壁上的ze
9、ta电势 熔硅毛细管表面上的zeta电势正比于它表面上的电荷数与对离子层厚度的乘积，但电荷数和对离子层厚度又会受到对离子的性质、缓冲液的pH、缓冲液中阳离子和熔硅基表面间的平衡等因素的影响。对于熔硅或聚四氟乙烯材质的毛细管，管壁上的zeta电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流、优化毛细管分离有重要意义。,毛细管电泳中的zeta电势,第二种：荷电粒子表面上的zeta电势 在电介质中，任何带电粒子都可以被看成是一个偶电层系统的一部分。在这个系统中，粒子自身的电荷被异号的带电离子中和，这些异号离子中有一些被不可逆地吸附到粒子上，而另一些则游离在附近，并扩散到电介质中进行离子交换。“固定”离
10、子有一个切平面，它和离得最近的游离离子间的电势称为粒子的zeta电势。,电泳,在半导体中，荷电粒子在外电场作用下的泳动现象称为电泳（electrophoresis）.带电粒子在电场中受到向前的力F F=qE 同时，带电粒子受到粘滞阻力F F=f u 当F=F，粒子以稳态速度运动，有：u=qE/f对于球形粒子，f由stokes定律给出，f=6 r,有：,电泳（续）,根据上式，电泳速度是和外加电场有关，所以电泳中常用淌度（mobility,）来描述荷电粒子的电泳行为和特性.电泳淌度（ep）定义：单位场强下离子的平均电泳速度 影响荷电粒子在电场中的迁移速度的因素有：电场强度、介质性质、粒子的荷电情况
11、、粒子的大小和形状,电渗（electroosmotic flow,EOF）,电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。在毛细管电泳里在所指的电渗是：在高电压下，溶液中的正电荷与毛细管管壁表面的负电荷之间作用，引起流体朝负极方向运动的现象。和电泳淌度相似，电渗淌度（eo）可表示为：,在普通的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，大小受到Zeta电势、偶电层厚度、介质粘度的影响，一般电势愈大、偶电层愈薄、粘度愈小，电渗流值就愈大。通常，渗流速度是泳流速度57倍,电渗（续）,粒子在毛细管中同时受到泳流和渗流两种运动速度的影响，粒子在毛细管电介质的运动速度应该是两种速度的矢量和：令app=ep
12、+eo为表现淌度（apparent mobility）或净淌度(net mobility),电渗（续）,从毛细管电泳测量中得到的淌度应为粒子自身的电泳淌度和由电渗引起的淌度的矢量和：式中：Ld-毛细管从进样口到检测器的距离 tm-粒子通过毛细管到达检测器的时间 Lt-毛细管柱长，V-电压,粒子的表观淌度,电渗（续）,各带电离子在毛细管中的流出顺序为：正 离 子运动方向与电渗一致 中性粒子泳流速度为零，随电渗而行 负 离 子运动方向与电渗相反，当eo ep时，最后流出，否则无法流出结论：只有当电渗速度的绝对值大于所有负离子泳流速度的绝对值时，混合物中的所有组分才将向一个方向迁移，才能检测出所有组
13、分,电渗（续）,通过以上讨论可得：表现淌度app可以从毛细管电泳的测量结果求得 电渗淌度eo可以用中性粒子按同样的方法测得 电泳淌度ep带电粒子的电泳淌度可用中性粒子为参照从式中求得,毛细管电泳流型,毛细管电泳是属于电驱动系统，在毛细管中流体的流型呈扁平型的塞子向前流动。,毛细管电泳的分类及主要应用方向,按分离机理分：毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管电动色谱（EKC）毛细管胶束电动色谱（MECC）毛细管电色谱（CEC）毛细管等速电泳（CITP）亲和毛细管电泳（ACE）非水相毛细管电泳（NACE),各种电泳的主要应用方向,小型离子:CZE CITP
14、 小分子:MECC CZE CITP肽类:CZE MECC CIEF CITP CGE蛋白质:CZE CGE CIEF CITP低聚核苷酸:CGE MEKCDNA:CGE,毛细管电泳仪,毛细管电泳仪的基本结构,毛细管电泳系统包括：进样、填灌/清洗、电流回路、毛细管/温度控制、检测/记录/数据处理等部分,毛细管电泳仪的性能,多种灵活的分离模式,电压、电流、功率、压力和真空可恒压、恒流、恒功率或梯度编程可压力与电压、电流、功率的组合可程序控制切换极性,毛细管电泳仪的性能,控温范围宽，至少应能够在2040内恒温 可选择的样品温度控制系统 半导体的温控系统可供选择 样品温度控制与缓冲液的温度控制分开
15、样品量可达192个 恒温精度能到达0.1,毛细管电泳仪的性能,准确、自动的进样系统性 具有精确的进样控制和校正系统，进样量准确 可直接从96孔样品板上自动进样，也可从2ml或0.5ml或PCR试管中进样 可电动、压力、真空或三者组合进样 可从毛细管两端的任一端进样 进样后，有等待功能,毛细管电泳仪的性能,最佳的缓冲液供给系统 可容纳36种缓冲液组合功能 缓冲液的温度控制与样品的温度控制分开 还有备选的4 x 25 ml 的大容量缓冲液瓶可供选择,毛细管电泳仪的性能,配备性能优良的检测器，以满足不同的应用 二极管阵列检测器（DAD）紫外检测器（UV/VIS）激光诱导荧光检测器（LIF）通用型外部
16、接口（EDA），连接 串联质谱检测器（MS/MS）电导检测器（Conductivity）等,进样,进样必须满足的要求：进样时不能引入显著的区带扩张 样品的量必须小于100nl，否则会引起过载 进样方式 真空进样 电进样 压力进样,进样-电动进样（电迁移进样）,电动进样属于普适性方法，是凝胶电泳进样唯一的方法 缺点：对离子组分存在进样偏向，即进样歧视,进样-压力进样,方法：压力进样也叫流动进样，要求毛细管中的填充介质具有流动性，也即当把毛细管的两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。,进样-压力进样,三种方式：正压 负压（管尾抽吸）重力（虹吸）正压进样的优点 进样过程中没有组分
17、歧视，在严格控制样品的粘度和温度下，进入毛细管的量是固定的,检测器,紫外检测(UV/VIS)二极管阵列检测(UV/VIS DAD)激光诱导荧光检测(LIF)间接检测(Indirect Detection)电化学检测 质谱检测(CE-MS/MS)化学发光检测,紫外检测光路图,二极管阵列检测器,间接检测法,CE间接检测法中，信号不是来自样品本身，而是来自背景电解质离子(缓冲溶液或加入其中的添加剂离子)。,样品溶质在毛细管中迁移时，为了保持局部区域的电荷平衡，要求置换同电荷离子，即在区带内产生电荷的物理置换，使背景电解质离子浓度降低，从而产生背景信号减弱。通过相对于稳态时背景信号的减弱(负峰)进行样
18、品溶质的间接测定。,间接检测法,特点：不要求分析物具有能被检测的信号特性，如光的吸收、发射、碎灭及电化学活性等 是一种近于通用性的检测方法，非常适合于无机离子、有机小分子、氨基酸和糖类化合物等的检测 不需要柱前或柱后衍生，分析物没有发生化学变化，是非破坏性检测，便于组分收集后作进一步研究,间接检测法,测定的机理是物理置换，可以根据所用仪器的类型来选择背景电解质离子(如吸收波长、电极电位等)由于间接法是在强背景信号下测定信号的微弱变化，灵敏度没有相应的直接测定法高 基线噪声大，存在基线漂移和较大扰动等缺点 具有通用性，对杂质也较敏感 采用的间接检测法有：间接吸收法、间接荧光法、间接电化学法、间接
19、化学发光法,CE检测器的检测限及其特点,毛细管区带电泳,毛细管区带电泳-分离原理,样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比（charge/mass比值）差异来进行分离，比值愈大,跑得愈快。,Capillary Zone Electrophoresis,毛细管区带电泳-分离原理,毛细管区带电泳-分离原理,特点 可使用凃层或未凃层的毛细管 避免样品吸附 抑制电渗透流 毛细管中除电解质外,无需填充任何物质 使用未凃层的毛细管进行分离时,不仅是正电荷，包括无电荷及负电荷物质都會向负电极移动(因为电渗流),所以可同时检测正电荷、负电荷及中性物质 以电解质之pH值、离子浓度、温度、毛细管电泳及电压大小来控制
20、分离状态,毛细管区带电泳-分离原理,主要应用 蛋白质、多肽及帶电荷的大小分子 可取代传统电泳及离子交换HPLC,胶束电动毛细管电泳,胶束电动毛细管电泳-分离设想,电解质中加入表面活性剂,使之形成胶束，样品根据疏水性的强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同,來进行分离 样品疏水性愈強,则进入胶束的机会愈大 通常物质进入胶束后,泳动的速度会变慢,因此疏水性愈強的物质則愈慢出來,胶束电动毛细管电泳-特点及主要应用,根据分子之疏水性及亲水性的強弱差异进行分离 可分离不帶电荷的物质,疏水性強的物质或电荷/质量比值相近之物质 对样品分子大小有限制，要求分子量小于5000（CZE则没有此限制）药物分析
21、、环境污染物分析及其他小分子物质 可取代反相HPLC,分离原理,被分离检测物质在水相和假固定相之间进行分配，由于它们在胶束中具有保留能力不同而产生不同的保留时间，所以溶质的迁移速度决定于溶质在两相间的分配系数,在胶束电动毛细管色谱中，中性粒子间的分离是根据粒子本身的疏水性的不同而达到的 不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力大，保留时间就大，反之，保留时间短 是唯一能分离带电粒子和中性化合物的模式,常用的表面活性剂有：十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、胆酸、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺等,MECC应用-七种青霉素的分离,CZE:20mM Pi-
22、Borate,pH 8.5,(B)MEKC:0.1 M SDS in(A)soln.,的迁移,毛细管凝胶电泳,毛细管凝胶电泳,毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)是20世纪80年代后期发展起来的毛细管电泳的分离模式，它将凝胶电泳对生物大分子的高效分离能力和毛细管电泳的快速、微量和定量分析相结合，成为当今分离度极高的一种分离技术。,目前主要用于生命科学和生物化学领域，如对大分子蛋白质的分离，分子量测定，DNA、寡聚核苛酸的分离与纯化。CGE与激光诱导荧光(LIF)检测技术相结合已成为DNA快速序列分析的优选方法。,分离机制,CGE的分离机制与凝胶电
23、泳相同，因凝胶具有网状结构，有分子筛作用 分离取决于溶质的净电性质、电荷多少和分子的大小 当带电溶质通过凝胶时，即按分子大小、电荷性质及电荷多少依次筛分 对荷电量不随分子大小而变化的大分子如DNA、SDS-蛋白质复合物，必须经凝胶筛分得到分离,CGE的特点,可分离蛋白质、DNA、RNA、多糖类及高分子聚合物,並确定其分子量 可改变Gel的浓度來控制分离的范围 分离介质凝胶黏度大，能减少溶质的扩散（分离对象为大分子物质，扩散系数小）,所得的峰形尖锐，是CE分离模式中柱效最高的(107/m)一种分离方法 可制成不同浓度的凝胶 可得到不同孔径的分子筛，用于分离不同分子量的物质,毛细管等速电泳(CIT
24、P),CITP基于有效离子淌度的差异进行带电离子的分离 属于不连续介质电泳，需要两种缓冲液 前导电解液：含有与溶质离子电荷相同且淌度为体系中最高的离子 尾随电解液：体系中淌度最低的离子 样品离子的淌度介于这两者之间,缺点：需要采用不连续缓冲体系，空间分辨率差,毛细管等电聚焦电泳,毛细管等电聚焦电泳,毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing，CIEF)是将常规等电聚焦凝胶电泳的高分辨率与现代毛细管电泳的特点相结合的一种毛细管电泳分离模式,用于分离不同等电点的两性大分子，尤其在分离蛋白质方面显示了较大的优越性，可分离等电点(pI)相差0.0lpH单位的不同蛋
25、白质 除测定pI外，还可用于其他方法无法分离的蛋白样，如免疫球蛋白、血红蛋白、血清转铁蛋白以及低浓度生物样品的分析,分离原理,等电点的定义：当蛋白质存在於某一个pH值环境下,其正电荷及负电荷的数目相等(净电荷等于零,不帶电),則此pH值即为其等电点(pI).,分离原理 电解质中混合凝胶及两性电解质,通电后，两性电解质会先形成pH梯度,样品会各自向其等电点移動,直到不帶电荷(等电点)時则停止移动,利用气压压力将已等电聚焦的样品推动,经过检测器进行检测,分离原理（续）,CIEF的电泳缓冲液由不同pH值范围的两性电解质组成(其 pH值范围应包括被分离溶质如蛋白质的pI值)，将溶质和不同pH值范围的载
26、体两性电解质的混合溶液注入毛细管柱,分离原理（续）,在电场作用下，带正电荷的溶质和两性电解质向阴极移动，带负电荷的则向阳极移动，形成pH梯度,分离原理（续）,溶质和两性电解质在不同pH值梯度下，通过介质迁移，而溶质的电荷将随pH值的变化而减少，直到不再移动，达到稳态，此时的pH值即为溶质的pI值，这一过程称等电聚焦,聚焦过程可用电流检测，当聚焦完毕，无电流通过,蛋白质只能在它的等电点位置，被聚焦成一条窄而稳定的区带，故能获得非常高的分辨率，不同的蛋白质有不同的等电点，能在CIEF中聚焦成不同的区带得以分离。,毛细管电色谱(capillary electrochromatography，CEC）
27、,毛细管电色谱,CEC是高效液相和毛细管电泳相结合的一种毛细管电泳分离模式。在石英毛细管柱内填充HPLC用的固定相或在毛细管壁键合固定相，以电场作用下产生的电渗流为驱动力推动流动相进行分离 CEC既保持CE高效、高分辨和快速的特点，又可选择不同的固定相提高选择性和扩大分离范围 根据溶质在流动相与固定相中的分配系数不同，荷电组分电泳淌度的差异进行分离,毛细管电色谱,能分离中性物质、阴离子和阳离子。克服了CZE分离中性物质的困难，同时提高了HPLC的分离效率 CEC在分离中性粒子时，不需像MECC那样使用表面活性剂，有利于和MS联用。亦可选用离子交换树脂对带电组分进行分离 CEC在分离手性化合物时可以在固定相上键合手性选择剂，也可用非手性固体相在缓冲液中加入手性选择剂进行拆分,毛细管电色谱,在分离过程中同时存在色谱和电泳双重分离机制 可用压力驱动对CEC系统的溶剂进行梯度洗脱，分离分子结构相近或电泳淌度接近的混合物 CEC柱的制备目前大多采用匀浆高压填充法和电动填充法，但柱的均匀度尚存在问题，气泡也不可避免,除填充柱外CEC还可用涂层的方法，在毛细管壁键合固定相，制备分离柱，例如将二甲基聚硅氧烷与甲基化的环糊精键合后再涂于毛细管壁制成手性分离柱 CEC已开始用于多环芳烃的芳香族类、蛋白多肽类、寡聚核苷酸类等的药物分析和对映体分离,EPO,
