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1、,感染性疾病血清标志物检测的发展与临床应用,传染病血清标志物,1.感染性疾病筛查2.HBV的检测3.HCV的检测4.HIV的检测,感染性疾病筛查,HBV、HCV、HIV等是感染性疾病术前筛查的重要指标2000年卫生部184号文颁发了“临床输血技术规范”的通知，特别强调了手术病人术前的筛查项目,国内感染性血清标志物检测特点,手工操作为主,自动化使用较少检测方法较多,ELISA方法占绝大部分使用仪器和试剂较混乱,试剂多达30几家,仪器多达50多种实验室之间检测结果存在较大差异,酶联免疫法（ELISA）术前病人筛查传统方法,微板法固相载体,优势简单，易操作成本低,缺点包被面积小，反应面积有限颜色反应
2、（灵敏度、特异性）包被均一性不足（精密度）反应时间不一致造成结果偏差（精密度低，熟练的操作人员其批间差也达20%以上）洗板容易带来污染手工操作，管理不易,电化学发光免疫测定（ECL）输血病人筛查自动化方法,方法学对比,传统（ELISA）优点：降低成本可实现自动化缺点：HOOK效应引起的假阳性非特异反应交叉污染引起的假阳性灵敏度低,对于窗口期感染的检出率低,容易导致假阴性的出现,现在（ECL）优点：异相免疫分析，抗原抗体高效结合，无传统一步法的缺点结果稳定，高精密度可控的反应体系快速的检测时间抛弃型tip头避免交叉污染缺点：成本相对较高,传染病血清标志物,1.感染性疾病筛查2.HBV的检测3.H
3、CV的检测4.HIV的检测,乙型肝炎:世界性的公共卫生问题,全球约有20亿人曾感染过乙肝其中3.5亿人为慢性HBV感染者,几乎一半在中国,性传播输血传播围产期传播,医院内传播,乙型病毒传播模式,感染,复制,血清学诊断三步骤,疾病活动期,血清标志物,HBsAg,anti-HBc,anti-HBe,HBeAg,HBV DNA,ALT,HBV疾病的发展,乙肝血清学标记物检测要点,感染后血清转换的早期即可检测出（缩短窗口期)分析灵敏度优异识别所有的亚型可靠地识别病毒变异株高特异性的表现高检测精密度,尤其是cutoff 处精密度表现尤为重要,乙肝表面抗原（HBsAg）,1963年由 Blumberg在澳
4、大利亚土著人血中发现，称为澳大利亚抗原（即以前所谓的“澳抗”）；又称为肝炎相关抗原（HAA）；1974年正式定名为乙型肝炎病毒表面抗原。HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y”和“w/r”，最常见的血清型为adw、adr和ayw。最常用的测定方法为ELISA，使用针对HBsAg的a决定簇的单克隆和多克隆抗体，为双抗体夹心测定模式。血清中检出 HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一 出现时间：HBV感染后26个月（潜伏期）,HBsAg检测易出现“假阴性”结果,HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下 如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等。
5、编码HBsAg的HBV S基因的突变。HBV容易发生突变，较其他DNA病毒的突变率要高10倍；S基因发生突变可导致HBsAg的 a决定簇发生改变，最相关的突变是G145R、K141E和T131I以及在122与123位残基之间3个氨基酸的插入，可明显影响HBsAg的抗原结构。丙型肝炎病毒（HCV）与丁型肝炎病毒（HDV）重叠感染对HBV复制和/或HBsAg表达的抑制作用测定方法所用抗体对 HBV不同基因型检测敏感性的不同。,HBsAg 检测的挑战之一：对于低水平HBsAg的检测,HBsAg 是 乙肝感染最早出现的血清学标记物灵敏度 是评价表面抗原的最重要的指标,2006年临床化学杂志 美国华盛顿
6、大学以前在HBV DNA检测方法不是很灵敏度的时候认为HBsAg 阳性而DNA阴性代表病毒的静默期，没有复制；随着更灵敏的DNA检测方法的使用，人们也发现HBsAg阴性而DNA阳性的状况；第一个原因是处于窗口期由于HBsAg的灵敏度决定的,中国低水平HBsAg的状态,浙江大学第一附属医院在2002年做的评估如下：8089例病人中2.34%1ng/ml(17.5%)72例 2ng/ml(38.10%)根据HBsAg II在华西医院的评估结果估计：每100例HBsAg II阳性的标本中，华西的检测方法会漏检5例。,国内外HBsAg诊断试剂灵敏度评估国家参考品adr血清的检测结果,HBsAg 检测的
7、挑战之二：缩短窗口期,与 ELISA 试剂窗口期相差平均20天,HBsAg 检测的挑战之三;对于突变病毒株HBsAg的检测,最常见的HBsAg突变位点,S基因的突变率,1988年意大利研究 2.0%的接种疫苗的人会感染HBV，确认是感染突变病毒株这些患者的血清学表现为表面抗原和表面抗体同时阳性其中最重要的突变是G145R，这个突变可以保持非常高的复制性其中发现的免疫接种的婴儿被感染多是由于这个突变造成的家庭间的水平传播,突变的重要原因,突变原因：自发突变（HBV聚合酶链反应的高出错率）选择性压力下的突变,疫苗接种/高效价免疫球蛋白的应用-疫苗的广泛应用，促使HBV 发生变异的免疫压力逐渐增大，
8、变异的机会增加治疗抑制（拉米夫定）,对于突变株无法识别也是漏检的原因之一,HBsAg 检测的挑战之四:不同亚型和基因型的检测,HBV有多个基因型和血清亚型,依据HBV全基因核苷酸序列异源性/8%或者s基因区核苷酸序列异源性/4%为分型标准，HBV可以分为AH的八个基因型。依据HBV的d/y(122-134);a(139-147);w/r(159-160)等决定簇的变化，将HBV分为四个主要的血清亚型不同的亚型可以同属于一个基因型同一个亚型又可以分属不同基因型,可靠地检测HBsAg不同基因型,Elecsys HBsAg II 如何实现能够检测变异株能力?使用了两种单克隆捕捉抗体和一种多克隆信号抗
9、体,罗氏新一代的表面抗原在此评估中没有发现突变漏检,Elecsys HBsAg II性能小结-用于筛查,临床灵敏度高分析灵敏度高0,05IU/ml临床特异性高,可达99.8%血清转化早期检测的灵敏度高可靠的HBsAg 亚型,基因型以及突变的检测能力cut-off附近检测的高精密度,为什么需要 HBsAg定量检测?HBsAg是监控慢性乙型肝炎治疗的指标,对于HBeAg阳性和HBeAg阴性的患者,理想的治疗终点是实现HBsAg的消失(伴随或者不伴随Anti-HBs的出现)。,EASL Clinical Practice Guidelines:Management of chronic hepati
10、tis B,Journal of Hepatology 50(2009),HBV DNA=病毒学标志,HBsAg=免疫学应答标志,HBsAg定量能够对CHB干扰素和核苷类似物的治疗进行监控,Pegasys,Pegasys and NA,NA,干扰素和核苷类似物是目前治疗慢性乙型肝炎的主要两类药物,定量,定量,定量,HBsAg Quant 是监控治疗和判断预后有效工具,Week,0,24,48,Brunetto MR,EASL-AASLD 2008,International Roche Infectious Diseases Symposium 2009,12,Follow-up随访,Pega
11、sys treatment治疗监控,Year,1,2,3,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAgIU/ml,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAg Quant,在治疗早期HBsAg Quant 比HBV DNA 具有更好的治疗监控价值,Elecsys HBsAg II Quant检测流程,HBsAg II Quant,稀释原始标本,检测范围52000 IU/ml,手工步骤,结果显示(IU/ml),(70%-80%标本在此范围),e411/2010(1:100)e601/e170(1:400)在线稀释,e41
12、1/2010(1:100)e601/e170(1:400)在线稀释,HBsAg II Quant,25的标本,52000 IU/ml,结论,理想的治疗终点是持续的HBsAg的消失。HBsAg是Pegasys治疗预后的良好的指示指标(而不是HBV DNA)。Elecsys HBsAg II quantitative assay可以仪器自动预稀释，并且达到很好的线性范围。60-80%的标本可以一次得到最终结果。,乙肝表面抗体（Anti-HBs）,抗HBs是一种中和抗体，其能在体内存在相当长的时间。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对 HBV的感染具有保护性免疫作用表面抗体(anti-HB
13、s)监控具有重要意义-国际标准 阳性 10U/l;-多国的共识 100 U/l 才具备保护能力-表面抗体定量检测具备溯源性,Anti-HBs 定量检测,乙肝e抗原（HBeAg）,HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV-DNA具伴随关系，是HBV复制活跃的血清学指标。HBeAg为HBsAg的可溶性成分，通常血清 HBeAg阳性者，其HBsAg亦为阳性。血清HBeAg阳性说明传染性强。急性乙肝患者血清HBeAg持续阳性 3个月以上，则有疾病慢性化倾向HBV抗病毒治疗的重要监测指标。,临床应用急性乙型肝炎早期指标乙型肝炎病毒感染的病人随访高度传染性的标志治疗监控,Elecsys HBeAg,分析灵敏度
14、 用参考材料82做方法比较(100 PEI U/mL),Elecsys HBeAg 灵敏度极佳,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,0,1,2,3,4,5,6,HBeAg concentration PEI U/mL,s/co ratio,Elecsys HBeAgAssay A,cut-off,Elecsys HBeAg 定值溯源性至 PEI 标准品 82,PEI 是 Paul-Ehrlich-Institute 的简称，它是德国的一个机构，隶属于德国卫生部。该机构成立已经100多年，主要的研究方向是疫苗、抗体、基因治疗、变态反应原研究等。它有很多职能，包括德国以及欧
15、盟的医学产品法规的制定；PEI 是的合作组织，只要职能是体外血液产品的质量确认。PEI 还提供以下标志物的参考品和国际标准品：HIV 1/2,HBV,HCV,HAV,Rubella virus and HCMV由于HBeAg没有 WHO标准品，所以目前PEI 标准品是最高级的国际标准品。,稀释灵敏度,Elecsys HBeAg的 COI结果具有半定量的分析能力,0.1,1,10,100,1000,10000,100000,0.1,1,10,100,1,000,10,000,log HBeAg PEI U/mL,log COI,recombinant HBeAg(5g/mL),2300 PEIU
16、/mL,目前在国外最高的自然标本为1450 PEIU/ml,HBeAg的值对于慢性乙肝抗病毒治疗的应用价值,HBeAg 的血清学转换是被认为是慢性乙肝治疗的最重要的短期目标。在治疗中和治疗前HBeAg的浓度对于抗病毒治疗的预示价值要超过HBV DNA。,Anti-HBe,乙肝e抗体（抗HBe）,当血清 HBeAg转阴后，可出现抗HBe，两者同时阳性较少见。抗HBe阳性说明病毒复制减少，传染性弱，但并非没有传染性。抗HBe不是保护性抗体。HBeAg抗HBe血清转换被看作是HBV感染过程的一个转折点。,Analytical sensitivity Dilution of PEI reference
17、 material(100 U/mL),检出灵敏度：0.2 PEI U/L,2.00,1.00,0.00,5.00,2.5,1.25,0.313,0.078,0.039,0.625,0.156,COI,Anti-HBe concentration PEI U/mL,COI,Specificity in blood donors(n=?),Cut-off index,Number of samples,Cut-off,Elecsys Anti-HBe 优异的临床特异性,Specificity=100%,HBeAg/Anti-HBe Concurrence,理论基础：处于转归期出现免疫复合物HBe
18、 Ag 和Anti-HBe同时出现的几率：出现的几率依赖于相应检查方法的灵敏度。对于免疫复合物的检测能力,临床价值：在多余HBeAg存在的条件下即能早期发现Anti-Hbe的血清转换，对于指导医生的治疗有更灵敏的应用价值。Journal of Medical Virology;60;256-63(2000),乙肝核心抗体（抗HBc）,在HBV感染中，最早出现的特异抗体是抗HBc。总抗HBc包括抗HBc-IgM、IgA、IgG和IgE等。抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。在HBV高流行人群中，抗HBc常作为疫苗免疫前的筛检方法。在欧洲和美国，抗
19、HBc还是血液筛查的一个指标。抗HBc测定中存在的最大问题是其假阳性和单项抗HBc阳性结果的解释问题。,Anti-HBc优越的阴阳性标本的区分能力,抗HBc“假阳性”结果的原因及解决办法,国内评估结果HBV五项结果最大的差异见于 Anti-HBc,ELISA 假阴性率很高。主要原因是血清（浆）中存在交叉反应性抗体或干扰性物质。标本不得不稀释检测，造成灵敏度降低如果不稀释检测，会有明显的干扰，造成假阳性罗氏Elecsys预处理血清标本将明显改善抗HBc检测的特异性；具有标本预处理的抗HBc试验的特异性在 99.8%至 99.9%之间。,传染病血清标志物,1.感染性疾病筛查2.HBV的检测3.HC
20、V的检测4.HIV的检测,丙型肝炎是全球面临的公共卫生问题,每年300400万新增HCV感染患者,China CDC Data,2008,中国CDC报告的丙肝病例逐年大幅增高,卫生部历年公布全国丙肝疫情,中国报告的丙肝病例在最近6年内几乎翻了6倍,21145,39380,52927,70681,100339,118016,0,20000,40000,60000,80000,100000,120000,2003年,2004年,2005年,2006年,2007年,2008年,丙肝人类健康的沉默杀手,丙肝起病隐匿，是容易被忽视的疾病一旦感染丙肝，仅20-30%感染者自发清除病毒慢性丙型肝炎患者有70
21、-80%无明显症状隐匿的丙肝患者会成为危险的传染源没有“病毒携带者”，有“毒”就要考虑治疗疾病发展越后期，越难治愈逐渐发展成肝硬化、肝癌等终末期肝病带来越来越沉重的疾病负担目前没有疫苗预防,丙肝发生肝硬化和肝癌的风险有多大？,HCV感染后肝硬化发生率：20年达10%；在感染后30年内达20%。,1%4%的HCV感染者会发展为肝癌,肝硬化,肝癌,急性丙肝感染的血清标志物图谱,慢性丙型肝炎感染的血清学图谱,实验室检测的现状,Anti-HCV 检测酶联免疫吸附实验-大批量处理化学发光自动化快速快速检测技术试纸条补充确认实验重组免疫印记实验(RIBA)Anti-HCV IgG/IgM检测HCV RNA
22、检测HCV血清学分析,HCV筛查面临的问题,假阳性率问题漏检不同ELISA试剂结果的不一致,HCV基因结构及其功能,C,E1,E2/NS1,NS2,NS3,NS4a,NS4b,NS5a,NS5b,核酸序列,5-nc,3-nc,342,914,1490,2605,3360,5312,6256,9371,核心蛋白,包膜蛋白,糖蛋白,功能不清,三磷酸核苷酸结合的螺旋酶,RNA聚合酶,功能,ELISA法检测抗-HCV,1990年美国公司用NS4蛋白的c100-3表位作为抗原，生产了第一代ELISA法抗HCV 试剂盒。1992年推出第二代ELISA法抗HCV 检测试剂。其包被抗原增加了非结构蛋白c33c
23、和结构蛋白c22-3作为抗原，灵敏度大大提高，窗口期从从16W缩短到10W。1995年推出了第三代ELISA法抗HCV 检测试剂，包被抗原为含c22-3、c33c、c100-3和5-1-1的重组蛋白，灵敏度和特异性得到进一步改善，平均窗口期缩短至7-8W。,Elecsys Anti-HCV,Core-Peptide rec.NS3-Protein NS4-Peptide aa 9-48 aa 1192-1457 aa 1689-1743,E 1,E 2,Core,RNA,Elecsys Anti-HCV 试剂中 应用的抗原,Elecsys Anti-HCV可以检测各种基因型,Elecsys A
24、nti-HCV 能够检测 HCV genotypes 1-6 种不同基因型,Elecsys Anti-HCV检测优势,优异的血清转化灵敏度 高灵敏度可用于HCV感染的早期检测，对于那些新感染患者的早期发现有助于他们的成功治疗。高的临床特异性 99.71%的血清盘检出率，不会因高剂量钩状效应造成任何的假阴性检测，检测同样不受自身抗体的干扰。灵敏的识别病毒变异株 病毒出现新的变异时，也能准确地检测出来，100%灵敏识别HCV主要1-6种基因型。快速的反应时间 18分钟,传染病血清标志物,1.感染性疾病筛查2.HBV的检测3.HCV的检测4.HIV的检测,AIDS,获得性免疫缺陷综合症（Acquir
25、ed Immune Deficiency Syndrome），艾滋病。1981年6月5日首先在美国于一同性恋者中发现。1983年由法国科学家分离出病原体-人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）；同年在非洲发现异性间传播并发现HIV-2。1985年第一个诊断试剂盒出现。,中国艾滋病流行现状,截至2009年10月31日，累计报告艾滋病患者和感染者近32万例，其中艾滋病病人10万余例。到2009年年底，存活的艾滋病感染者和病人总数估计达74万人。31个省(自治区、直辖市)全部已发现HIV感染者。三种传播途径均已存在。,数字反映出来的 不过是冰山一角 中国
26、艾滋病：危险的泰坦尼克号,HIV感染的实验室检测,HIV感染包括病原学检测和免疫学检测。病原学检测包括病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒核酸检测等。免疫学检测主要检测人体产生的特异性HIV抗体，是目前HIV/AIDS诊断中最常用的方法:HIV抗体检测 确认是否感染的依据。,HIV检测试剂发展的历程,1985 HIV抗体ELISA试剂、全病毒裂解抗原（第一代）1990 HIV抗体ELISA试剂、基因工程或合成肽抗原（第二代）1992 HIV1/HIV2抗体ELISA联检试剂1994 HIV抗体双抗原夹心法ELISA试剂（第三代）1994 HIV抗体唾液检测试剂1996 家用HIV-1检测系统199
27、6 HIV-1P24抗原检测试剂1996 HIV1抗体尿液检测试剂1997 HIV1/2/O抗体ELISA试剂1998 HIV-1/2抗原抗体联检试剂（第四代）1998 HIV抗体确认WB试剂1999 HIV-1RNA定量检测试剂2002 HIV1基因型耐药性检测试剂2003 HIV抗体快速检测试剂,抗体诊断试剂的种类,第一代：1985年，主要使用来自T淋巴细胞系中培养的HIV病毒的裂解产物，这类抗原通常会同时有宿主细胞成分的污染，从而造成假阳性。为减少非特异性，通常不得不降低包被的抗原浓度，另外，杂蛋白的存在会与抗原竞争包被位点，因此第一代试剂的灵敏度也受到了一定的限制。第二代：主要使用基因
28、工程重组和/或人工合成肽做为抗原，采用间接法的原理检测HIV IgG抗体，与第一代相比明显地提高了试剂的灵敏度，但该类试剂仍存在局限性 第三代：采用双抗原夹心法，从而可同时检测所有类型抗体，提高了试剂的敏感性，同时特异性也得到了提高，另外，由于能检出IgM抗体，可以起到缩短窗口期的作用，有报道说较第二代产品平均可提前5天作出诊断。第四代：将HIV抗原和HIV p24抗体同时包被载体，再加入待检血清，最后加入酶标记的HIV抗原和HIV p24单克隆抗体，同时检测血清中的HIV p24抗原和HIV抗体,HIV检测面临的挑战,病毒自身的特点：窗口期、高度变异防治工作需要：发病率监测、简化样本采集和检
29、测方法，提高方法的便捷性针对新问题，建立新方法(自然感染与疫苗应答、新药物的应用),窗口期漏检是造成假阴性最重要的原因占实验室假阴性报告原因的93.7,第四代HIV检测窗口期较第三代试剂要提早6天同时检测HIV P24抗原和抗HIV 抗体,检测早期HIV感染具有良好的敏感性,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,5.1.1.3 筛查方法（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）（2）化学发光或免疫荧光试验（3）快速检测（RT）及其它检测试验 明胶颗粒凝集试验（PA）免疫渗滤试验 免疫层析试验,5.1.1.4 筛查程序,（1）初筛试验（2）复检试验 对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一
30、种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确证实验室进行确证试验（图1）。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应，而抗体试剂检测为阴性反应，则应考虑进行HIV-1 p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,方法对比,传统(ELISA)HIV抗体检测，易漏检手工处理需大批量处理标本,现在(ECL)HIV抗原抗体联合检测，缩短窗口期
31、，降低漏检风险自动化，安全随机处理标本，快速出结果,术前四项收费,Thank you for your attention,Roche Diagnostics(Shanghai)Limited Shanghai 200031China,This presentation is our intellectual property.Without our written consent,it shall neither be copied in any manner,nor used for manufacturing,nor communicated to third parties.,COBAS and LIFE NEEDS ANSWERS are trademarks of Roche,
