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1、第五章 植物花药和花粉培养,主讲：洪森荣（生命科学学院）,植物单倍体培养方法:,花药培养、花粉培养胚珠或子房培养（未受精）,植物花药/花粉培养历史,Guha和Maheshwari（1964）曼陀罗花药培养Nitsch 和 Norreel(1973)烟草花粉培养（游离小孢子培养）Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）,80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功。,概念：,花药和花粉培养
2、：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉小孢子体发育途径”或“雄核发育”。,油菜成熟花药的结构,花粉囊,花粉囊壁,成熟花粉粒,花药裂口,（一）花粉发育时期：1、适宜时期：单核期，尤其是单核中、晚期(单核靠边期),花粉粒形态：,花粉粒即雄配子体。为2细胞花粉或3细胞花粉,2-细胞花粉,3-细胞花粉,两者的异同点,培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。,花药或花粉培养的作用：
3、,1、作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小 孢子培养仅需一年。,例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。,（2）提高了目标基因型的选择效率,ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb,例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。,（2）提高了目标基因型的选择效
4、率,植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。,（3）诱变育种中的作用,2、物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。3、遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。,4、构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。5、用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响。,花粉孢子体发育途径（雄核发育）,一、花粉发育的阶段,花粉离体培养时，雄核发育最适宜的
5、时期一般是第一次有丝分裂或之前。,二、雄核发育途径,1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞。（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体,（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株,2、B途径,小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。,D为自然条件下小孢子的第2次有丝分裂，形成淀粉粒并萌发出花粉管。,1、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜
6、能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）（Potential embryogenic pollen）（Small pollen）（No stain pollen）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。WHY?,三、雄核发育启动机理,小孢子雄核和营养核,母体内：雄核很快 S期DNA复制 DNA达到2C水平 营养核保持1C水平停留在 G1期或G0期离体培养时：饥饿处理营养核很快 DNA复制DNA达到2C水平形成花粉胚胎,饥饿处理为什么会引起营养核启动复制？,1、引起细胞质正常形成过程中止；2、引起含有中心球结构的花粉粒（C-type）形成前期胚
7、状体3、引起液泡花粉粒（Vacuole-type，简称V-type）形成死亡4、引起核体积减少，配子体途径的信息分子退化或消失5、引起Ca2+的重新分布胚胎发生,1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。,四、花粉植株形态发生方式,胚状体发育途径,部分花药通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,通过胚状体途径再生形成小植株,烟草花药培养,胚状体发育途径,芸苔属小孢子培养,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,水稻花药培养,水稻花药培
8、养,花药和花粉培养方法,一、花药培养,1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。,3、培养,固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。,二、花粉培养,(一)花粉的分离与纯化 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花
9、粉挤出后收集培养。,3、机械游离（1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子,梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）,30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）,(二)花粉培养方式,1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培
10、养基。,4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。,看护培养图解,花药,花粉颗粒,滤纸片,无性系或克隆,三、白化苗现象,（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。,（
11、二）白化苗的控制,通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。,具体方法：,1、花粉取单核中晚期；2、4低温预处理花粉2h；3、愈伤诱导在黑暗和25 培养，温度不能太高，太高易白苗；4、愈伤诱导尽量用2,4-D与KT或6-BA组合；5、蔗糖浓度降低；6、出愈尽快转分化培养。,四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素,（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。如在水稻中，籼xin 稻花粉培养力远低于糯nu 稻。,芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较,Topas 10,000-200,000 1
12、-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1,基因型胚状体数量/106小孢子 成苗率（%）,（二）供体植株生长条件和生理状态1、植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量,（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。,四分体:醋酸洋红染色,四分体:Alexanders 染色,单核期,双核期,成熟花粉粒,处于不同发育时期的烟草小孢子,一般而言，单核期（第
13、一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。,形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。,不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期,对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化,处于不同发育阶段的烟草花芽,花粉发育时期的确定,（四）预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、
14、射线等。,1、高低温处理低温预处理：指在接种之前将材料用0以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。,预处理方法：,例子:小麦穗子培养前4预处理几天，花药培养效率显著提高。十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。,高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。例子:如烟草，32高温；小麦，33高温预处理显著地提高了小孢子胚胎
15、发生能力（Touraev，1996）,2、化学物质处理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。,3、其它,包括（伽玛）射线、离心、磁场等。,（五）培养基,1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-培养基（适于马铃署）,2.碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为
16、最好的碳源。,3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH,（六）培养条件,1、温度 物种间有差异2、光照 3、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到2104ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。,（七）花药壁因素 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。,单倍体植株鉴定和染色体加倍,一、倍性鉴定（为什么要进行倍性鉴定？）,1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。,2、间接鉴定,（1）扫描细胞光度
17、仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。,（4）杂交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）,二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）,（一）茎段培养将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中
18、会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。,二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）,（二）化学试剂诱变有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。后面三种均为除草剂。,1、秋水仙素诱导,（1）浸泡法 无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理 秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理 将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。,2、除草剂诱导（毒性小，引起植株的变异几率小）,花药和花粉培养基本流程：,花药和花粉培养基本流程：,选择合适的供体植株（F1？）预处理（物理或生理逆境）(pretreatments,media,etc.)REGENERATE MANY PLANTSRECOVER DIPLOIDS BY CHROMOSOME DOUBLINGEVALUATE PLANTS/PROGENY FOR DESIRED GENE COMBINATIONS?USE IN BREEDING PROGRAM?,
