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1、细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术,赵万洲 博士南京凯基生物科技发展有限公司,Apoptosis-(Gr.falling)a process seen in multicellular organisms,by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism.,Kerr,J.F.R.,Wyllie,A.H.and Currie,A.R.1972.Br.J.Cancer 26:239.,细胞凋亡（apoptosis）,概念：程序化细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是多
2、细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。,a、凋亡概念的形成和形态学的研究(1972）1965年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡（programmed cell death）概念。1971年 澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987）c、蛋白质水解酶活化的研究(1995)d、细胞膜的变化(1997)e、线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-
3、)1)相关基因及调控 2）信号转导 3）各种分子及其相互作用及相互关系 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。,凋亡的研究历史,Science.2005 Oct 7;310(5745):66-7.,细胞凋亡的研究意义在胚胎发育过程中：通过凋亡可清除对机体无用的、多余的、发育不正常的、以及有害的细胞。在成年机体中：通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新生的细胞；清除体内受损伤的或有癌前病变的细胞，防止癌变；凋亡还参与构成机体的防御机制。,细胞凋亡异常是某些疾病发病的重要原因：如凋亡不足引发恶性肿瘤、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生艾滋病、重症肝炎与老年性痴呆症、帕金森氏症等，因此研
4、究细胞凋亡已成为生命科学、医学病理学、药理学等学科的热点领域。细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾病的认识。,Normal,Apoptosis,Necrosis,细胞凋亡的信号转导通路,死亡受体信号通路线粒体信号通路内质网和高尔基体的信号通路细胞凋亡的基因调控,Apoptosis-Death Receptor Signaling,TNF receptor superfamily,Apoptosis,Cell death,FasL,TNF,TRADD,FADD,Cas8,1993年，研究发现秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1
5、b 转化酶(interleukin-1b-converting enzyme,ICE)存在功能和序列相似性。ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。1996年10月，推荐将ICE/Ced-3家族成员统一命名为Caspase（Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases），按发现先后为序对其家族成员以阿拉伯数字排序（1-14）。,Caspase家族成员特性一览表,注：W为色氨酸，E谷氨酸、H为组氨酸、D为天冬氨酸、I为异亮氨酸、L为亮氨酸、V为缬氨酸、X为任何氨基酸,（by Thonberry,1997),Caspase活化的三种方式,Caspase的活化
6、,破坏细胞抗凋亡因素 正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需要的。破坏细胞结构 Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结
7、构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。影响核酸的结构与功能 Caspase可作用于多种与DNA，RNA功能有关的蛋白，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。,Caspase的效应机制,Nature.2008 May 29;453(7195):583-5.,Caspase-independent signaling pathways,1、线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡过程中对线粒体损伤的最直接结果是其正常功能的丧失。线粒体功能障碍除了会导致自由基产生增
8、加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载而引起细胞凋亡外，还能直接诱导细胞凋亡。2、此通路由含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl一2家族成员与另外的Bcl一2家族成员(Bax亚家族成员Bax，Bak等，主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆)作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C(Cytc)和其他蛋白。Cytc的释放是线粒体凋亡路径的主要 步骤：在ATPdATP存在的情况下，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease-
9、activating factor，Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域(caspase recruitment domain，cARD)募集胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化并启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡。Cell.2007 Nov 2;131(3):476-91.,线粒体信号通路,Mitochondrial Control of Apoptosis,内质网内钙离子稳态的改变可作用于内质网功能的多个环节，引发细胞凋亡。内质网钙离子的释放在多种凋亡实验中
10、被观察到。内质网的钙释放参与Bad和caspase在不同诱因凋亡中的激活。破坏内质网内钙离子的稳态可以导致内质网应激，包括内质网超负荷反应，激活凋亡通路。其中内质网超负荷反应以激活转录因子NF-kB为主要特点，启动多种前炎性蛋白和细胞粘附分子的转录表达，对凋亡进行调控。,内质网信号通路,Science.2007 Nov 9;318(5852):944-9.,过度内质网应激也可能涉及线粒体及细胞色素C的协同作用而使caspase激活和细胞凋亡。内质网应激介导细胞凋亡调节的一个主要因素是Caspase-12。在多种疾病的发生发展中，内质网在完成基本生理功能的同时，作为信号传导的枢纽平台，对于细胞凋
11、亡过程发挥着重要的调控作用。,Bcl-2家族 Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3和BH4。,细胞凋亡的基因调控,Bcl-2亚家族：Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用 Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。BH3亚家族：Bik
12、、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。作用机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能,P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。,P53与细胞凋亡,IAP超家族的
13、成员较多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP 和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。c-IAP1、c-IAP2和 XIAP含有环指装结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-和-的泛素化降解作用。,IAP（Inhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子）,Gene.2007 May 1;392(1-2):187-95.,Apoptosis Assays,细胞凋亡诱导剂,化学
14、诱导剂H2O2化疗药物 物理性因子放射线UV生物因子 Anti-Fas TNF Trail,细胞凋亡的形态学变化,细胞凋亡的形态学检测方法,光学显微镜 荧光显微镜(Hoechst 33342，Hoechst 33258,DAPI)电子显微镜,光学显微镜观察,荧光显微镜观察,电子显微镜观察,细胞凋亡的生物化学检测方法,磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）TUNEL法DNA片断化检测DNA Ladder 测定DNA含量分析,磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）,不同凋亡阶段的区分,流式细胞仪分析（FACS）,流式细胞仪定量分析细胞凋亡,荧光显微镜定性观察细胞凋亡,TUNEL法 细胞
15、凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。,TUNEL法,检测原理：,凋亡产生的断裂的DNA-TdT酶标记dUTP-Biotin-结合链霉亲和素-HRP-作用于底物DAB显色,Tunel 原位凋亡检测试剂盒
16、,检测方法,细胞涂片、贴壁细胞爬片,Tunel 原位凋亡检测试剂盒,检测结果,DNA Ladder 试剂盒,检测原理 DNA片段化 激活核酸内切酶 核小体连接区发生DNA降解，寡核小体片段（160200bp的倍数)检测材料与方法 细胞或新鲜组织，裂解蛋白酶和RNA酶消化提取DNA片段琼脂糖电泳检测结果:琼脂糖电泳图片,DNA片断化检测,DNA Ladder,DNA含量分析碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群,G1,S,G2/M,细胞凋亡的
17、分子水平检测方法,Caspase分子的检测线粒体膜势能的检测JC-1凋亡相关分子的检测促凋亡分子抑凋亡分子相关信号通路分子的检测,Caspase分子的检测,Caspase3、8和9，2，6等,Caspase检测方法,分光光度法检测FACS检测Western Blot检测全长检测剪切体检测,Caspase分光光度法试剂盒,检测原理：活化的Caspase与其特异性底物DEVD-pNA 结合切割，释放出游离pNA，通过测定其吸光度，根据其发光强度的高低代表其活化程度。检测材料与方法 活细胞、新鲜或速深冷冻组织制成的细胞悬液裂解蛋白定量加入底物反应测定吸光度,Caspase分光光度法试剂盒,检测结果：
18、相同蛋白量下受试组与对照组的OD值之比或不同蛋白量OD值的变化曲线图,OD405nm,裂解蛋白量(ug),Caspase 3 FACS检测,Caspase 3 Western Blot检测,通过对Caspase底物PARP等的降解产物的检测反映Caspase的活性。通过针对Caspase 催化的降解产物采用IHC、Western Blot、FCM进行检测。,116Kd Full length PARP,85Kd Cleaved PARP,原理：JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿
19、色荧光。,线粒体膜势能（JC-1）的检测,荧光显微镜检测FACS检测,JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,检测结果：,线粒体膜势能的检测(JC-1),凋亡相关分子的检测,促凋亡分子Bax,Bcl-Xs,Bak,Bad,Bid,AIF,Apaf-1和cytochrome c等抑制凋亡分子Bcl-2,Bcl-XL和bcr/abl kinase等端粒酶活性检测试剂盒氧化应激系列检测,相关信号通路分子的检测,抗凋亡信号通路PI3K-Akt pathwayNIK-NF-kB pathway促凋亡信号通路MKK-JNK pathwayFas-FADD pathwayP53 pathway,凋亡分析总体原则,凋
20、亡分析总体原则：1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性；3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。,综合解决方案,研究目的 检测指标 产品选择指南,根椐实验材料类型选择检测方法和产品,常见问题及解决方法,1 试验前阶段 凋亡指标的选择及实验方案的设计 A 实验材料：类型与数量 B 仪器条件 C 研究经费 D 论文水平,常见问题及解决方法,2 试验阶段 A 自备试剂浓度，配制方法 B 操作经验及注
21、意事项 C 根椐具体材料的试验条件优化3 结果分析 A 阴性：没结果 B 阳性：假阳性 C 结果不明显 D 结果异常,a、确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间。b、由于EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。d、因为细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。b、细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而导致细胞的进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在2的BSA中。,Annexin V凋亡检测常见问题,TUNEL检测常见问题,问：电泳结果中DNA 片段模糊，
22、得不到清晰的Ladder，原因是什么？答：可以考虑以下原因：细胞凋亡进行过度，有非特异性的DNA 片段。推荐提早取样时间。操作中混入DNase。应防止DNase 混入（如实验戴手套等）。问：电泳结果无DNA 片段检出，为什么？答：可以考虑以下原因：没有发生细胞凋亡。可使用凯基TUNEL试剂盒等确认细胞凋亡是否发生。DNA 量太少，无法检出。增加处理样品的细胞数或者尽可能使用少量的TE Buffer 溶解提取样品DNA。问：Solution A 低温下产生沉淀，怎么办？答：在40左右加热，即可溶解。溶解后的溶液可以正常使用，不影响实验结果。问 贴壁细胞用什么方法剥离细胞较好？答 用细胞刮勺剥离较
23、好，与使用Trypsin 剥离细胞方法相比，前者剥离的细胞的片断化DNA Ladder较为清晰。,DNA Ladder 检测常见问题,1 JC-1避光保存及使用。2 细胞培养的数量不宜超过1106，否则细胞会产生自然凋亡影响检测。3 有些对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间4 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。,JC1检测注意事项,Caspase活性检测常见问题,1、本试剂盒可用于细胞、新
24、鲜组织，细胞数量需达到35106个，以便能达到测定需要的100200g蛋白的要求，因为Caspase的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞数量的方法来提高蛋白量。新鲜组织需制备成细胞悬液后使用。2、因为SDS、TRITON-100，NP40等常用去污剂虽然裂解效果好，蛋白提取效率高，但会影响Caspase的活性，因此本试剂盒的lysis buffer 采用温和的非离子表面活性剂CHAPS，裂解效果略低，但不影响Caspase的活性。3、可通过冻融1-2次来增加蛋白提取量4、注意低温操作，避免酶失活，5、caspase Substrate避光保存及使用6、设立阴性和阳性对照组。,细胞周期检测常见问题,常见问题与解决方案1、G0/G1突然发生变化或漂移a、流式细胞仪管路中有气泡或被阻塞，建议检查管路是否通畅或是否有气泡b、PI浓度不够，建议增加PI低浓度c、与PI孵育的时间不够长，建议增加孵育的时间 2、峰宽 a、流式细胞仪的流速太快，建议调整流式细胞仪的流速 b、样品中有气泡，检查样品中是否有气泡 c、样品中有坏死细胞，建议更换样品 3、无样品峰 a、可能样品中无细胞核，坏死细胞过多，建议显微镜观察样品或更换样品 b、细胞碎片过多,Thank You!,
