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1、第三章 分子克隆工具酶,第一节 限制性内切酶第二节 甲基化酶第三节 DNA聚合酶第四节 其他分子克隆工具酶,第一节 限制性内切酶,一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、线性DNA末端对酶切的影响五、酶切反应条件六、酶切位点的引入,一、限制与修饰,细菌的限制与修饰系统(R/M系统)由限制酶（限制性核酸内切酶）和修饰酶（甲基化酶）组成。R/M系统的作用：保护自身的DNA不受切割；破坏外源DNA使之迅速降解。噬菌体在不同宿主中的转染频率。（见p17）实验说明：K菌株和B菌株中存在一种限制作 用，可排除外来的DNA.,限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制,识别自身遗传物
2、质和外来遗传物质,AN6-MeAC5-MeC,限制酶的发现 美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身DNA，从而找到Hind II限制性内切酶。限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。限制酶的生物学功能用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。,限制酶的种类型酶(种类很少，
3、只占1%)三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP有特异识别位点但没有特异切割位点型酶(占90%以上)分子量较小，反应只需Mg2+；识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对称结构上；多数型酶切割DNA后形成粘性末端 型酶(种类更少，不到1%)二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3端2426 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。,限制酶的命名原则第1个字母：大写，来自微生物属名第1个字母第2和3字母：小写，来自微生物种名前两个字母其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号 罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号例：EcoR I 来源于Escheria coli RY13的第一个限制
4、酶，其识别序列为：GAATTC；,二、限制酶识别的序列,识别序列的长度一般为48个碱基，最常见的为6个碱基.4 bp识别序列：Sau3AI GATC5 bp识别序列：EcoR CCWGG(W=A/T)6 bp识别序列：EcoR GAATTC7 bp识别序列：BbvCI CCTCAGC8 bp识别序列：NotI GCGGCCGC当DNA中可识别的序列在完全随机的情况下：识别序列为4个碱基时，平均每256个(44)碱基中会出现一个识别位点；识别序列为6个碱基时，平均每4096个(46)碱基中会出现一个识别位点。,识别序列的结构大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。限制酶切割的位
5、置大多数在识别序列的内部，如EcoRI、SmaI等；但也有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如Sau3AI(GATC)。,三、限制酶产生的末端,限制酶产生黏性末端在对称轴5侧切割底物，DNA双链交错断开产生5突出黏性末端，如 EcoR I；在3侧切割，则产生3突出黏性末端，如Pst I；,限制酶产生平末端在回文对称轴上同时切割DNA两条链，产生平末端，如Hpa。限制酶产生非对称突出末端当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvC的识别切割位点如下：CCTCAGC GGAGTCG,同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。同序同切酶：识别序列和切割位置都相同Hpa与Msp识
6、别切割位点为CCGGMob与Sau3A识别切割位点为GATC同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同Kpn：GGTACCAcc65：G GTACC“同工多位”酶：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。EcoR I：GAATTCApo I:RAATTY(R=A/G Y=C/T),同尾酶可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。EcoR：GAATTCApo I:RAATTYMfe I:CAATTC稀切酶有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制酶称为稀切酶。在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。,四、线性DNA末端对酶切的影响,DNA末端长
7、度的影响限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则难以发挥切割活性。一般在识别序列末端有3 4个碱基对时能满足常规的酶切需要。,位点偏爱(site preference)某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱。pBR322质粒上有4个Nar位点，在标准条件下1单位Nar可在1h内将2个位点完全切割，但另外2个位点在50单位16h内也不能切割完全。造成位点偏爱的原因在切割DNA之前需要同时与2个识别位点作用；在要切割的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。,五、酶切反应条件,缓冲液包括Tris-
8、HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白)限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3种类型H Buffer(100 mM NaCl)；M Buffer(50 mM)；L Buffer(0 mM)反应温度：大多数为37 反应时间：通常为1h或更多终止酶切的方法：10 mM EDTA；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质,星星活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。引起星星活性的原因甘油浓度高（5%）酶过量（100 U/l）离子强度低（25 mM）pH值过高（8.0）加了有机溶剂，如乙醇等降低星星活性的措施减少甘油浓度；减少酶用量；中性pH；提高盐浓度
9、；反应体系中无有机溶剂；保证使用Mg2+作为2价阳离子,六、酶切位点的引入,将产生的5突出末端补平后，再连接可产生新的酶切位点同尾末端的连接平末端连接,第二节 甲基化酶,甲基化酶(methylase)的概念甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。甲基化酶与对应的限制酶识别相同的序列，在两条链上对某个碱基进行甲基化。,甲基化酶的种类 在E.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶Dam甲基化酶可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用dam-E.coli扩增并提取DNADcm甲基化酶识别CCAGG或CC
10、TGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5位置上引入甲基EcoK甲基化酶 识别AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中A的N6位置,甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点Hinc可识别序列GTCGAC，甲基化酶 M.Taq可甲基化 TCGA中的A，M.Taq处理DNA后，GTCGAC 将不受 Hinc切割产生新的酶切位点Dpn是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA 受 M.Taq处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A，其中 G*ATC 即为 Dpn位点。对基因组作图的影响,第三节 DNA聚合酶,一、大肠杆菌DNA聚合酶二、Klenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四
11、、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶,DNA聚合酶(DNA polymerase)的概念催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。原核细胞有3种DNA聚合酶DNA聚合酶：催化单链或双链DNA的延长DNA聚合酶：与低分子DNA链的延长有关DNA聚合酶：促进DNA链延长的主要酶,大肠杆菌DNA聚合酶功能53DNA聚合酶活性53外切核酸酶活性35外切核酸酶活性用途在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位；当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性处在动态平衡中，结果使得双链DNA成为平末端。利用53外切核酸酶活性,可用切口平移法标记D
12、NA。,切口平移法标记DNA，制备分子杂交探针,KlenowDNA聚合酶由E.coli DNA聚合酶经蛋白酶裂解后，除去53外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。功能53DNA聚合酶活性35外切核酸酶活性用途 补平DNA的3凹端 抹平DNA的3凸端 通过置换反应对DNA进行末端标记 随机引物标记,T4噬菌体DNA聚合酶从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。功能53DNA聚合酶活性35外切核酸酶活性（200倍）用途35外切核酸酶活性强，且不从单链DNA模板上替换引物。在诱变反应中可提高诱变率近一倍。,T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密结合
13、的蛋白质形成的复合体。功能53DNA聚合酶活性35外切核酸酶活性（1000倍）应用DNA聚合能力强，可用于长模板的引物延伸，在DNA测序中有优势。,耐热DNA聚合酶指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜高温的细菌，主要用于PCR反应。Taq DNA聚合酶Vent DNA聚合酶PfuDNA聚合酶PwoDNA聚合酶,反转录酶(reverse transcriptase)即依赖于RNA的DNA聚合酶，有53合成DNA活性，但是无 35外切核酸酶活性。禽成髓细胞瘤病毒（AMV）包含两条多肽链，具 53DNA聚合酶活性和很强的RNaseH活性，在42能有效发挥作用。Moloney鼠白血病病毒（M-Mu
14、LV）单链多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成较长的cDNA用途：以mRNA为模板合成cDNA；5突出DNA的补平和标记；DNA测序等。,末端转移酶(terminal transferase)来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在Co2+/Mg2+存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH端。作用标记DNA的3末端在cDNA或载体3末端加同聚尾，便于克隆。,第四节 其他分子克隆工具酶,一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶,一、依赖于DNA的RNA聚合酶,活性即转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿
15、此DNA模板起始RNA的合成。聚合反应时，无需引物，但需识别特异性位点。类型SP6噬菌体RNA聚合酶(来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株)T4噬菌体RNA聚合酶T7噬菌体RNA聚合酶(来源于噬菌体感染的大肠杆菌)应用：体外合成RNA分子、表达外源基因。,二、连接酶(ligase),连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。连接酶的种类T4 DNA连接酶(16反应)活性：催化DNA 5-P与3-OH之间形成磷酸二酯键。反应底物：黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA连接大肠杆菌DNA连接酶：平末端连接效率低。Taq DNA连接酶(4565反应)连接双链DNA中的缺口，不
16、能代替T4 DNA连接酶。T4 RNA连接酶,黏性末端DNA片段的连接,三、T4 多核苷酸激酶,T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP的-磷酸基团转移到DNA或RNA的5末端。分子克隆中呈现2种反应将ATP的-磷酸基团转移到无磷酸的DNA5末端在过量ATP存在的情况下，可将DNA的5-P转移给ADP，然后DNA从ATP中获得-磷酸而重新磷酸化。应用对缺乏5-P的DNA进行磷酸化对DNA末端进行放射性标记（-32P-ATP）。,四、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶是一类能催化除去DNA或RNA分子的5 磷酸，使末端转换成5-OH的酶。类型牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）细菌碱性磷酸酶(BAP)虾碱性磷酸酶
17、(SAP)用途去除5-P，防止DNA片段自身连接标记(5端)前去除DNA或RNA的5-P,如何解决质粒自身连接？,五、核酸酶,BAL31核酸酶具有3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端迅速去除单核苷酸。用途从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体；制作DNA限制酶切图。S1核酸酶一种单链核酸酶，降解单链DNA或RNA，产生带 5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链。用途DNA黏性末端变为平末端，打开双链cDNA合成中产生的发夹环。,核糖核酸酶A(RNase A)内切核酸酶，特异攻击RNA上嘧啶残基的3端。用途去除DNA样品中的RNA 核糖核酸酶H(RNaseH)内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的R
18、NA上的磷酸二酯键，产生带有3-OH和5-P末端的产物，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA.用途在cDNA克隆合成第二链之前去除RNA,脱氧核糖核酸酶(DNase)来源于牛胰，为内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA.用途去除RNA样品中的DNA切口平移标记时在dsDNA上产生随机切口外切核酸酶(exonuclease)催化从dsDNA 3-OH端逐一去除单核苷酸的反应。底物为线状dsDNA和带切口或缺口的环状DNA.用途制备部分截短的DNA，用作探针制备单向缺失的DNA等。,本章涉及基因工程操作中大多数工具酶的特性及其用途，知识点多，内容分散，涉及面广，需要花多点时间复习才能掌握！,本章复习要点,1、限制性内切酶：分类、命名原则、识别序列、黏性末端、平末端、同裂酶、同尾酶、稀切酶、酶切反应条件、星星活性等2、DNA聚合酶：各种酶的活性特点、切口平移法标记DNA的原理、各种酶的用途等3、RNA聚合酶的活性与用途4、连接酶的类型与用途5、T4多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途6、几种核酸酶特点及用途,
