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1、分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业,随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。1.检测临床标本中病原体核酸序列。2.肿瘤基因突变情况。3.遗传性疾病的基因序列。4.人类白细胞表面抗原（HLA）配型。5.法医学方面的鉴定工作。,PCR技术在临床实验室应用的价值,优点：1.灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。2.特异性强，对于一个19核苷酸的引物来说，非特异性配对的概率为419=2.75*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组DNA片段的最小长度，而人的基因组长度为3*
2、109碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。3.可以早期诊断，如在HCV的感染中，第一周内就可以检测出HCV RNA，而抗体的产生一般在第二周以后。,PCR在诊断病原体感染时的优缺点,4.对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者，PCR却可以作出明确诊断。5.可以对病原体作定量分析，反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。6.可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。,不足之处:,1.操作复杂，技术不易被熟练掌握。2.价格昂贵。3.出于敏感性太高，操作步骤多而复杂，即使有极少量的污染也会造成假阳性。4.由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有差错就会出现假阴性。,几点认识,一.今后
3、仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自 动化；二.样品采集方式对PCR很重要，比操作更重要。三.内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。四.从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本 同步进行；,五.禁用产物的电泳分析技术。六.探针杂交技术和防污染技术的采用是一大 进步。,一.标本的采集,常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有
4、不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。,二.标本的稳定化处理,用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场
5、采样。异硫氰酸胍盐（Guanidine thiocyanate,GITC）可使 DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按14的比例加至含有5mol/L GITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。,三.标本的运送,标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通常在运送时，应采用不易破
6、碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。,四.标本的贮存,临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液（）中4保存，用于 RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20即可。用 GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。,五.标本的处理（核酸提取）,标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸
7、制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理(血清或血浆按14的比例加至含有5mol/L GITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA降解
8、的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。,一.内源性物质(影响因子）,1.类风湿因子2.补体3.嗜异性抗体4.嗜靶抗原的自身抗体5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体6.交叉反应物质7.标本中其它成分的影响,二.外源性物质,1.标本溶血2.标本受细菌污染3.标本保存不当4.标本凝集不全5.标本管中添加物质的影响,PCR测定的临床应用及测定结果的临床意义,结核分支杆菌病原学：结核分支杆菌复合群（MTBC）：人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲型结核分支杆菌和田鼠型结核分支杆菌，后者无致病性。对人有致病性的主要是人型结
9、核分支杆菌，牛型引起人类发病已很少见。此外分支杆菌报道有100余种，1994年国际公认有56种，常用非结核分支杆菌（NTM）或其他分支杆菌（MOTT）的名称。培养：15-20小时一代，2-4周 看到 培养基上的菌落。抗菌治疗后需4-8周或20周才出现菌落。,引物设计：结核分支杆菌共有的靶序列：65KD人型结核分支杆菌特异的靶序列mpt40MTBC特有的靶序列，如IS6110插入序列rRNA序列，以16S-rRNA为模板cDNA扩增，高度保守，TB有高达1000-10000拷贝数，具很高的灵敏度和特异性。注意问题：标本处理痰、胸腹水：液化剂，红细胞裂解液,临床应用评价：Tb 与其他分支杆菌区别：
10、AIDS 鸟分支杆菌，龟分支杆菌TB 耐药基因含菌量较低标本分离TB敏感性：远高于直接涂片和培养 涂片镜检：10000-100000菌/ml，培养：10-100个活菌PCR：1-20 个结核杆菌，但不能鉴别死菌和活菌，不能反映抗结核治疗的效果；还可见临床无结核病证据涂片和培养均阴性而PCR阳性的情况，这在理论上可诊断结核，但临床上很难被医师认同，这涉及所谓金标准的问题，目前还远不能就此情况下PCR阳性的生物学意义和价值作出评价。,沙眼衣原体Chlamydea trachomatis Ct,病原学：三个生物变种：沙眼生物变种A-K12个血清型性病淋巴肉牙肿变种LGV3个血清型，人是天然宿主鼠生物
11、变种鼠是天然宿主，不侵犯人，与鼠肺炎有关病原学检验：涂片、抗原抗体检测、核酸检测,四种衣原体的性状比较,PCR：16SrRNA基因高度保守衣原体属特异引物7.5kD 质粒及MOMP(主要外膜蛋白)基因适于构建种或型特异性引物根据沙眼衣原体内源性质粒序列设计合成的一对引物:1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG.扩增片段517,可扩增15个已知血清型的沙眼衣原体.实验证明,此引物不扩增其他眼部常见微生物和正常人核酸,而对临床49例诊断为沙眼的标本阳性率为63%,敏感性和特异性均超过细胞培养法和免疫荧光法与酶免疫法等常规方法,灵敏度达到能检出1个衣原体D
12、NA分子.,特别要注意的问题:取材:一定要取到细胞临床评价：金标准培养免疫学：荧光主观判定 EIA金葡、链球菌、淋球菌-交叉 反应 PCR：假阴阳性,人类组织相容性抗原(HLA),组织相容性（主要组织相容性复合体MHC）系统的概念：有I、II、III类I类：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-HL等II类:HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP，HLA-DO，HLA-DN，HLA-M,等位点III类:为补体系统C2，C4，Bf等。HLA抗原的分类:I 类和 II 类抗原多态性、共显性遗传：已发现的HLA基因位点(等位基因数)约400左右,HLA分型
13、的基本方法血清学方法:基本原理活的淋巴细胞表面有大量的HLA-A,HLA-B,HLA-C HLA-DR抗原,在与特异性的同型抗体结合后,有补体存在时会被杀死,经过染色，根据淋巴细胞被杀死的百分率,可以决定待测淋巴细胞是否具有某一特异性的抗原.细胞学方法:基本原理检测的抗原属于HLA-DP，HLA-DQ两个位点，如果两种淋巴细胞表面抗原不同,在一起培养，不同抗原互相刺激，淋巴细胞增殖并向母细胞转化；否则，这两种细胞会保持不变。,HLA分型的基本方法常用X射线处理已知HLA-DP，HLA-DQ特异淋巴细胞，失去增殖能力保持刺激能力，与待测淋巴细胞混合培养，若不发生增殖和母细胞化即认为与已知特异性细
14、胞同型，否则为不同型别淋巴细胞.HLA-DR基因分型:(例)序列特异性引物PCR法合成19对引物,21管加公共引物DR型别.,HLA抗原：一.HLAABC抗原:与疾病相关HLAA,B与器官移植的关联没有D的配型意义显著,C无意义.二.HLAD抗原:与器官移植配型相关DR座位上的等位基因数比AB座位上的少,在随机人群中挑选到DR抗原配合的供体要比选择AB抗原配合的供体容易,所以目前器官移植主要做DR配型.,遗传病检测,遗传病是由基因在性细胞的突变引起的一。PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针法对已知突变热点基因检测：PCR-目的基因-膜 杂交 发现突变位点 合成正常及突变寡核苷酸探针一个等位基因
15、有一种ASO探针,要证明待测标本是否属于这一等位基因,要进行一次杂交显示信号的操作,这对于致病基因有多个突变可能性的诊断(地中海贫血在中国有18种突变类型,全球有100多种),操作繁杂甚至不可能.二。PCR扩增特异等位基因在3末端设计突变位点,根据特异性PCR产物出现与否判断突变的存在.,三.限制性片段长度多态性分析突变位点与酶切位点相关 出现新的电泳图谱四.单链构象多态性分析(SSCP)PCR扩增靶DNA;将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发
16、现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.,不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变.
17、Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.,UNG酶/dUTP防污染系统,本试剂盒中加入了dUTP以保证PCR只选择性地扩增临床中的靶DNA。UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）能识别并催化酶解含有dUTP 的DNA结构，但不会对含有dTTP 的DNA的结构识别并催化酶解。dUTP 不存在于自然的DNA中，只有运用dUTP 替代dTTP的PCR反应之
18、中产生的扩增子中存在。这种dU化的PCR产物与UNG酶一起孵育后使其失去再被扩增的能力，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖苷键，可去除dU，使无dU的位点阻止TaqDNA聚合酶的延伸。UNG酶可从单链或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无作用。UNG酶在正常PCR循环变性一步就可被灭活，所以对含dU的新的PCR产物没有影响。,肿瘤研究中的分子生物学,肿瘤分为:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌:90%的人类肿瘤,起源内胚层及外胚层上皮细胞肉瘤,白血病/淋巴瘤起源中胚层细胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纤维细胞以及血液和淋巴系统中的循环细胞肿瘤发展的多步性.病毒癌基因
19、:肿瘤病毒:,有致癌能力的DNA病毒:(6个病毒家族)乙肝病毒,猴病毒40,多瘤病毒,乳头瘤病毒,疱疹病毒,痘病毒只有一类RNA病毒致癌反转录病毒肿瘤抑癌基因的发现:Hanis1960年,正常细胞与肿瘤细胞融合杂合体细胞不致瘤正常细胞中具有肿瘤抑制基因产生肿瘤表型的负调节物当杂合体细胞某段染色体丢失后细胞变为肿瘤表型-这段染色体上有重要的肿瘤抑制基因,抑癌基因:P53多种肿瘤.早期发现肿瘤中P53表达增加,认为是癌基因.正常P53基因抑制肿瘤形成,肿瘤中过量表达的是P53基因突变体作为显性抑制物影响P53功能致癌P16,PTP多种抑癌基因WT1肾母细胞癌DCC结肠癌APC家族性腺瘤息肉癌变广义
20、的讲,许多在细胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修复基因，其突变也会导致肿瘤的发生,它们的存在间接地起到抑制肿瘤的作用,临床评价1、假阳性与假阴性2、阳性率与“金标准”3、临床实践是最重要的依据,遗传病诊断,地中海贫血：珠蛋白序列中的的十几种点突变；3-碱基特异的PCR或ASO.地中海贫血:16号染色体珠蛋白序列中基因簇的三种大片段缺失；每条染色体上各有两个紧密连锁的基因，故一对16号染色体上共有四个珠蛋白基因（/）缺失1个基因-+珠蛋白合成障碍性贫血缺失2个基因-0珠蛋白合成障碍性贫血缺失3个基因-HbH病缺失4个基因（全部缺失）-Hb Barts胎儿水肿综合症非缺失型珠蛋白合成障碍性贫血不
21、终止HB constant spring,遗传病诊断,甲型血友病：X-连锁隐性遗传病，（长距离PCR技术）唐氏综合症（21三体）：三体形成配子期；智力低下，1/800全基因组分析法:多个具有多态性的位点进行连锁分析。,生物芯片：PCR技术在HLA-DRB1基因配型中的应用：序列特异性引物PCR（SSP-PCR）：,基因诊断是指检测感染者体内病毒核酸的有无,或含量多少来进行病原学诊断的一类方法。病毒性肝炎基因诊断包括病毒基因种类及含量、基因分型、亚型和变异及准种等的诊断。甲型肝炎和戊型肝炎无慢性化,且有较好的血清学诊断指标,故一般不需进行基因诊断。HGV和TTV,病毒性肝炎的基因诊断,定性和定量
22、PCR：定性检测主要是用于未知感染者的诊断,确定患者是否感染了肝炎病毒,结果分别报告为阳性或阴性。定量测定：己知感染者的抗病毒治疗时动态观察疗效,结果报告需以量来表示。如高出定量范围上限，则需对标本稀释后再测,低于定量范围下限时,则报告小于copies/ml,不能以阴性形式报告。,病毒性肝炎的基因诊断,肝炎病毒,甲型肝炎病毒与戊型肝炎病毒由消化道传播，引起急性肝炎，不转为慢性肝炎或慢性携带者。乙型与丙型肝炎病毒主要由输血、血制品或注射器污染而传播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并与肝硬化及肝癌相关。丁型肝炎病毒为一种缺陷病毒戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）TT型肝炎病毒（TTV）
23、SEN型肝炎病毒（HSV）,甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）,HAV的生物学性状,属小RNA病毒科，直径27nm，无包膜呈20面立体对称外面为一独立外壳，内含一个单链RNA分子,HAV的电镜照片,Feinstone（1973）,HAV的结构,HAV的致病性,粪口途径传播,口咽部或唾液腺中早期增殖,肠道与局部淋巴结中大量增殖,入血并形成病毒血症,肝脏为最终靶器官（病毒直接损伤或免疫病理作用）,通过胆汁随粪便排出体外,HAV的免疫性,HAV只存在单一的抗原抗体系统，即HAVAg和抗-HAV 无论显性感染还是隐性感染均能诱生出高效价抗-HAV 抗-HAVIgM阳性是甲肝的确
24、诊依据 IgM型抗体在感染后仅持续存于3-6个月IgG型抗体则可存在多年,Time course of HAV infection,HAV的其他生物学特性,培养特性 原代肝细胞或恒河猴胚肾传代株细胞对HAV敏感，生长缓慢，不引起细胞裂解抵抗力 比肠道病毒更耐热，601h不被灭活，100oC 5分钟可灭活 对乙醚、酸处理（pH 3）均有抵抗力 氯消毒、紫外线照射、福尔马林处理均可破坏其传染性,常见症状,流感样症状厌食恶心黄疸（眼部及皮肤呈黄色）尿黄腹痛乏力,微生物学检查,感染早期可检测血清中的抗HAV IgM流行病学调查可检测抗HAV IgG对已接种甲肝疫苗者检测中和型抗HAV抗体直接检测抗原或
25、用分子生物学方法检测病毒RNA,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）,HBV-DNA,病原学：HBV属嗜肝DNA病毒科，部分双链DNA，3200碱基对，10个亚型，序列表明不同亚型的变异为10%，同一亚型的变异为2%。检测：病原体抗原、抗体核酸临床评价：,HBV的基因组结构,3.2Kb不完全双链环状DNA，含4个ORF,可将微孔板包被有蛋白质（如亲和素或链霉亲和素、抗Dig-抗体、牛血清白蛋白）或已知序列的核苷酸，此为通用型活化微孔板，任何探针末端只要含有相应配体或与已知序列互补的核苷酸都可与相应的活化微化板固相化。我们设计了HBV特异探针，其-端含-段与通用板已知序列互
26、补的核苷酸，引物5端修饰有生物素，HBV DNA PCR产物与固相化探针杂交后，即可用酶标亲和素进行酶呈色测定，并证实其测定敏感度至少高于普通电泳法100倍。,HBV DNA定量测定的临床意义,为临床诊断提供更全面、精确的资料真实、全面地反映HBV感染、复制及病情变化过程 抗病毒治疗的分子水平监测用HBV DNA的血清浓度的变化来评价抗病毒药物的疗效,：荧光探针1：荧光探针2：引物：PCR扩增产物：Taq酶,扩增及检测原理,a：变性，双链模板裂解成两条单链,b：退火，引物、荧光探针分别结合到单链模板的相应位点，探针3端激发基团和探针5端的发光基团紧靠在一起，发出640nm的荧光,c：延伸，随聚
27、合反应的进行，结合在模板上的2条荧光探针被替换下来。,d：一个循环结束，生成2条双链模板,不同临床标本组中的HBV DNA检出率,不同临床标本组中HBV DNA阳性的定量结果,电镜下的HBV,Dane 颗粒,HBV的小球形颗粒,HBV的管形颗粒,HBV的复制,HBV的抗原组成,表面抗原HBsAg核心抗原HBcAg e抗原HBeAg,表面抗原HBsAg,存在于三型颗粒中是HBV感染的主要标志分亚型（a,d/y,w/r,adr）产生抗-HBsPre S1、Pre S2及抗-Pre S1和抗-Pre S2,核心抗原HBcAg,仅存在于Dane颗粒中不易在血液中检出可在感染的肝细胞表面存在刺激机体产生
28、抗HBc（IgG、IgM）表明病毒在复制,e抗原HBeAg,仅存在于Dane颗粒中游离存在于血液中为病毒复制及强传染性的指标产生抗HBe，是预后良好的征象,HBV的其它生物学性状,培养 黑猩猩动物模型、鸭动物模型 用分子生物学技术的细胞培养成功抵抗力 抵抗力强于HAV 对低温干燥紫外线耐受 不被70乙醇灭活 100 10分钟可灭活,HBV的致病机制,免疫低下：HBsAg无症状携带者病毒变异：逃逸免疫细胞介导的免疫损伤：为主免疫复合物性的免疫损伤：肝外损伤自身免疫反应的免疫损伤：肝特异性脂蛋白抗原,HBV的传染机制,传染源 主要传染源是患者或无症状HBsAg携带者传播途径 密切接触 血液及体液
29、母婴传播 不严格集体预防接种、药物注射 针刺、文身等,乙型肝炎的特点,我国约有40%-60%人群曾受到过HBV的感染表现急性乙肝的仅占0.1%-1%，亚临床30%-75%，慢性乙肝1%-5%，乙肝病毒携带7%-20%)急性乙肝如治疗不彻底，10%患者可转为慢性乙肝,乙肝五项及HBV DNA的临床意义,HBsAg、抗HBsHBeAg、抗HBe抗HBc（HBcAg）HBV DNA,乙型肝炎病毒抗原,特别是表面抗原,在血液中的浓度较高,现症HBV感染明确诊断。仅抗HBc单项阳性,也可在血清中检测到 HBV DNA乙型肝炎的诊断往往不需要进行病毒核酸的检测。抗病毒治疗时,血清中的病毒核酸含量是反映病毒
30、数量和复制活跃程度最可靠的直接指标、动态观察药物疗效的确切指标,特别是对于HBeAg阴性患者。,预防及免疫,控制传染源，切断传播途径人工自动免疫：疫苗（血源性、基因工程)人工被动免疫：高效价人血清球蛋白（HBIg）,丙型肝炎病毒（hepatitis C virus）,HCV的生物学性状,4060nm球形有包膜单正链RNA,HCV的基因结构,丙型肝炎的特点,我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染,HCV的诊断及预防,检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗,H
31、CV-RNA,HCV是引起输血后肝炎主要致病因子，因为血中HCV含量仅为HBV的千分之一，加之其免疫学标志仅有抗-HCV一项，至今HCV分离尚不成功，其检测较HBV困难得多，因此分子生物学方法在此应用显得格外重要。,丙型肝炎基因诊断及意义,结果判断抗HCV(+)伴ALT，或已排除其他肝炎的慢性肝炎，可诊断为丙肝。抗HCV(+)，ALT N。必须检测到HCV-RNA(+)（定性）才诊断丙肝。,丙型肝炎基因诊断及意义,结果判断抗HCV(-)，临床怀疑丙肝。应做HCV-RNA二次定性或有一次定量(+)，可诊断为丙肝。常见于免疫功能低下或缺陷、少数儿童和老人。急性丙肝抗HCV检出率为50%-90%，应
32、检测HCV-RNA。抗病毒药用治疗必须用定量PCR检测反映药物疗效。,HCV-RNA,病原学：单链正股RNA 病毒基因组长度10KB，为一个连续的ORF，包含多个结构区和非结构区的蛋白基因。HCV变异及其亚型：序列变异率在3.2-28%之间,不同国家和地区分离的毒株基因差异很大,同一患者在不同时期分离的毒株也有变异.HCV基因组分为I-IV型和若干亚型.,定量检测HCVRNA:1.可用于急性丙肝的早期诊断,在HCV阳性之前2.可作为HCV感染有无传染性的指标3.作为抗病毒疗效的指标,HCV的生物学性状,4060nm球形有包膜单正链RNA,HCV的致病性与免疫性,传播途径似HBV是引起输血后慢性
33、肝炎和肝硬化的主要原因潜伏期：4-8周无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见诱发肝外损伤：肾小球肾炎 免疫力不牢固,丙型肝炎的特点,我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染,HCV的诊断及预防,检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗,HCV的诊断及预防,丙型肝炎病毒：中国普通人群抗 抗体的阳性率为3 2%全世界约1 7亿人感染了目前除了干扰素()或其与利巴韦林联合应用对部分患者有一定疗效疫苗研究：由于包膜糖蛋白2中和性抗原位点存在高变区1(1)进展甚微,抗原表位
34、：线性表位、空间表位。如果以特异性抗体对化学合成的随机噬菌体多肽库进行筛 选,则很难筛选到与原始的抗原序列完全一致的序列,而是获得大量与原始抗原序列完全不同的多肽片段。这种一级结构序列与原始抗原不同,又保留其抗原反应性的抗原表位,称为模拟表位()。从其结构而言,模拟表位多数是构象表位(),即空间表位。噬菌体表面展示技术的建立和应用促进了抗原模拟表位的研究。国外学者应用噬菌体表面展示技术筛选获得了不同的结构和非结构蛋白抗原的模拟表位。这些研究结果首先在免疫学理论上阐明了抗原 抗体分子之间相互对应的多样性的问题,同时由于模拟表位的抗原性较强,且具有广谱性,因此,在新型诊断试剂和广谱疫苗的研究中具有
35、重要的应用前景。,HCV的诊断及预防,丙型肝炎病毒感染的诊断,第三代血清学检测试剂较好的敏感性和特异性,但20%患者可不出现抗体,或有的患者抗体存在时间可以很长现行感染，早期诊断因此,核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多。,丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）,HDV是一种缺陷病毒由HBsAg构成其外壳HDV定位于肝细胞核内，在血液中由HBsAg包被，形成35-37nm颗粒单负链环状RNA,HDV的结构,Rizzetto于1977年首先发现，又称 抗原35-37nm球形颗粒；1.7Kb-ssRNA含9个ORF,丁型肝炎的特点,只能感染HBsAg阳性的病
36、人我国丁肝感染率在1.6%-5%，西南地区感染率高患者可不定期隔离，或隔离至肝功能正常，或HBsAg阴转。病原学检查为HDAg、抗HD及HDV-RNA，持续高滴度IgG型抗HD是慢性HDV感染的主要血清学标志。一旦乙肝患者感染了HDV，尤其是在慢性乙肝的基础上感染，容易发展成为重度慢性乙肝、重型肝炎，甚至肝硬化。,微生物学检查及预防,诊断为检测抗-HDHDV-RNA丁型肝炎传播途经与乙型肝炎相似。传播途径和防治原则似HBV。,戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）,球形，无包膜直径3234nm单正链RNA，3个ORF两个血清型,致病性及免疫,主要为粪口途径传播由胆汁经粪便排
37、出体外对肝细胞的直接损伤及免疫病理作用多表现为急性戊型肝炎孕妇感染常致流产,戊型肝炎的特点,与甲型肝炎相比，患者黄疸前期症状重，病程持续时间较长，病死率较高，特别是孕妇感染HEV后。青壮年是HEV最喜欢攻击的人群。戊型肝炎分两种：“流行性”多发生在雨季和洪水后，“散发性”在秋冬季呈现高峰。传染性强的时间在患者将要出现症状前(潜伏末期)至发病初期，患者的隔离期为起病后3周。尚末发现有2次发病者。,微生物学检查及预防,检测HEV：EM或IEM检测抗-HEV IgMHEV RNA预防与甲肝类似,TLMV病毒（TTV-liked mini virus,TLMV）：2000年Takahashi TTV-
38、DNA引物作PCR，检测抗-HCV阳性血浆，10份TTV DNA滴度105拷贝/ml，其中3份（分别为CBD231、279和203）血浆PCR产物的长度较预期为短（约1.2kb），该病毒的全长DNA序列较TTV为短，分别为2 860nt（CBD231株）、2 856ntBD279株）和2 897nt（CBD203株），证明是一种新病毒，命名为TTV样微小病毒（TTV-like mini virus，TLMV）.,准种的研究：集中在RNA病毒（RNA病毒变异大，复制快，短时间内感染个体中即可形成一个彼此密切相关的异质性病毒群体.）HCV和HIV病毒的准种特性：实质是进化的一种生存优势，病毒最大限
39、度地制造自己的大量变异序列，这些序列中可能包括了潜在有用的变异体，对抗病毒制剂有抵抗能力能逃避CTL攻击和诱导免疫耐受的突变体.这样当环境改变后病毒可以快速的作出反应，从而保证其在宿主体内的生存,最近的研究还发现病毒准种象人体免疫系统一样具有记忆能力，当准种再次遇到经历过的环境作用时，保存在突变谱内的少量病毒株将迅速大量复制成为准种的主导序列.因此如果病毒准种的复杂性越大，治疗难度就可能越大.,在HCV的研究中已发现，病毒准种的异质性越大，对IFN-的应答性就越差DNA病毒的HBV也存在准种特性.已有少量的研究报道证实了这种假说，有关HBV准种复杂性与IFN-应答性之间相关性研究尚未见报道.H
40、BV不仅存在准种特性，且在慢性乙型肝炎中准种的复杂性和异质性还很大.同时也发现，在IFN-应答的患者中，准种的复杂性明显小于非应答患者，这与在HCV的研究发现相一致.,肝脏天然免疫系统的研究意义：肝脏NK细胞研究NK细胞是天然免疫的核心细胞,在肿瘤及病毒的免疫监视中十分重要,国内该领域研究十分薄弱。肝脏是机体天然免疫的核心器官,近3年才形成此概念,国际上研究亦十分薄弱,有望形成自有学科优势。,DL C-1基因表达与肝细胞癌复发转移的关系应用实时定量聚合酶链反应(RQPCR)研究位于8P的DLC l基因mRNA表达与肝细胞癌侵袭转移的关系。收集5l例复旦大学中山医院外科手术切除的肝细胞癌(H C
41、 C)及癌旁正常组织标本，根据临床病理学指标，分为高低侵袭性两组，用RQPCR对不同侵袭性H CC之间的DLC l基因表达进行分析。对不同侵袭转移潜能Mtt CC 9 7一LMHCC97一H、HCCLM3、Hep3B及HepG2肝癌细胞系用同样方法分析DLCl基因的表达差异。结果非转移细胞系Hep3B和HepG2与转移细胞系MHCC97一L、MHCC97 H和ttCCLM 3之间DLC l基因表达差异有统计学意义(尸001)，并随着侵袭与转移潜能的逐步提高DlJC l表达水下也相应逐步降低；HCCLM 3细胞系显著低于MHCC97 L细胞系(P001)。HCC组织中，高侵袭忡HCC组DLCl基
42、因表达明显低于低侵袭性HCC组(P005)。结论DI Cl基因表达与肝癌的侵袭转移的抑制相关，其表达可能在抑制肝癌的侵袭转移中发挥重要作用。,RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(IIBSAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSUper C，观察其对HepG2 221 5细胞(简称2、21 5细胞)中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对IIBV核心区的相应序列，再将其克隆入含聚合酶H l R NA 启动子的真核表达载体PSUPe r，将此重组质粒以电转染法转入221 5细胞中，用酶联免疫吸附法(Ab
43、bott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。结果经酶切鉴定、电泳和测序分析证明，成功构建了含作用序列的重组质粒pSUper C；但以电穿孔法转染221 5细胞后末能发现其对221 5细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。结论RNAi在221 5细胞中的作用还需进一步的实验来证实。,乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义细胞外乙型肝炎病毒(HBV)DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，约3200个碱基，含有HBV基因组的全长基因，在其5 起始端与3 末端之间
44、有一数个碱基的“缺刻”；正链较短，有较大的“缺口”，其3 木端不固定，故长度是可变的，约为负链长度的50100。在HBV的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)。治疗前后肝细胞内HBV cccDNA含量的变ft应该纳入到抗一HBV药物评价的指标体系中来，从一定意义上说，只有能够彻底清除HBV cccDNA的药物，才能算是真正“有效”的抗病毒药物。,cccDNA不同于rcDNA，后者存在于HBV核心中，外有核衣壳蛋白保护，因而在血液中是
45、比较稳定的；而cccDNA原本存在于肝细胞核中，不与蛋白共价结合，肝细胞被破坏释放到血液中时从理论上讲应该是裸露的核酸分子，因此在血液中是否稳定尚存疑问。但我们认为HBV cccDNA是一种不断折叠而形成的超螺旋结构的DNA分子，不同于一般的双链DNA，既然用真核质粒作载体的各种DNA疫苗能通过机体的各种屏障被机体摄取而不被破坏，我们推测类似结构的乙型肝炎cccDNA在血液中应该也是稳定的。,SEN病毒：一种新近发现的肝炎病毒？1999年Primi等在1例感染人类免疫缺陷病毒的静脉毒瘾者血清中分离出一种新的可能导致急、慢性肝炎的单链DNA病毒，并以该患者姓名的首位字母暂时命名为SEN病毒（se
46、nvirus，SENV）。SENV是一种无包膜、线状单股负链DNA病毒，长度约为3800kb。SENV的开放读码框（ORF）1氨基酸残基为642762个，N末端富含精氨酸/赖氨酸区相对保守。SENV的ORF1具有3个Rep蛋白基序。SENV的ORF2含有146166个氨基酸。ORF3与ORF1的3端序列部分重叠，有8188个氨基酸组成，在ATG起始密码子上有一个TATA功能区。它与经输血传播病毒（TTV）原型株的核酸序列同源性低于50%，氨基酸序列同源性仅为3%。因此，它不是TTV亲缘关系较远的病毒变异株，而是一群不完全相同的病毒组成新的亚科的代表。目前至少可分为AH等8个基因亚型，各型间氨基
47、酸序列差异在15%50%之间。在目前已知的8个基因亚型中，仅SENVC/H和D亚型与慢性肝病关系密切。SENV两个结构区的基因位点变异频率为7.3210-4/年,病毒性肝炎药物核 苷 类 似 药,为一种强的单磷酸次黄嘌呤核苷脱氢酶抑制剂，阻碍病毒核酸合成。适应证：用于肾综合征出血热和丙型肝炎治疗剂 量：口服0.81.0/d，34次分服副作用：有致畸和引起溶血，可致心肌损害和引 起呼吸困难。,利巴韦林（病毒唑，Ribavirin,Virazole）,适应证：抗疱疹病毒，VZV病毒；其单磷酸盐（Ara-MP）可抑制HBV。副作用：消化道、中枢神经系统、肝损害及骨髓 抑制等毒性反应。注 意：不可静脉
48、推注，滴速应慢，配制的液体 不可冷藏；不可与别嘌呤醇合用，以免 增加毒性反应。,阿糖腺苷（Vidarabine）,三磷酸化后具抑制HIV逆转录酶活性，可口服，生物利用度达80%以上，对宿主细胞增殖作用和骨髓毒性小，易产生抗药性，与AZT伍用可减少毒性反应。适应证：HIV感染剂 量：每次0.03mg/kg，6次/d；与AZT交替使用副作用：主要为末梢神经炎（灼痛、刺痛），其他有皮疹、发热等,脱氧胞苷（2,3-dideoxycytidine,ddC）,口服吸收较好，生物利用度可达40%，其活性部分在细胞内半减期12h，可每日两次给药。如果先予AZT治疗8周后再用ddI，可更有效地防止病情进展，提高
49、存活期适应证：HIV感染剂 量：每日3.29.6mg/kg副作用：外周神经痛、胰腺炎、头痛、失眠、恶心、呕 吐、发热、皮疹等。,脱氧肌苷（2,3-dideoxyinosine,ddI）,最初用于HIV感染，以后发现其对HBV DNAP有抑制作用，细胞毒性作用小，动物实验无致癌性。适应证：HIV，近年主要用于HBV感染。剂 量：每日一次，每次100mg口服，不能间断副作用：较小，但可引起YMDD变异等，影响疗 效。,拉米夫定（Lamivudine,3TC）,人工合成的嘌呤类抗病毒药，抑制HSV的DNAP，对细胞的DNAP也有轻度抑制作用。适应证：HSV-、HSV-、VZV、EBV、CMV治疗，对
50、 HBV也有作用。剂 量：口服200mg，1次/4h或每日1g，分次给予；静滴每次5mg/kg，缓慢滴注持续1h，1次/8h7天副作用：一时性肌酐升高、皮疹、出汗、血尿、低血压、头 痛、恶心等。不能与青霉素、丙磺舒、头孢菌素合 用，以免增加毒性。,阿昔洛韦（Aciclovir，无环鸟苷，Zivirax）,为第二代核苷类似药，口服后迅速吸收转化为有抗病毒活性的潘昔洛韦（Penciclovir）,生物利用度达77%，有抑 制HBV DNAP的活性，但对细胞聚合酶的亲和力小。适应证：HBV感染，对HSV-和HSV-及VZV均有作用。剂 量：对HBV感染每次500mg，3次/d口服4个月；对疱 疹病毒
