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1、分子生物学实验,实验七 限制性内切酶酶切质粒DNA,1、实验原理 限制性内切酶或限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease,简称RE）是一类能够识别双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶，并在此特异位点将双链DNA切断。限制性内切酶都是从原核生物中发现的，也称细菌性酶。限制性内切酶是细菌为防范外源DNA而产生的一类酶，它可识别DNA双链上的特异性位点，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，并从该点将DNA分子切断，产生DNA片段的5为P，3为OH,而宿主内的DNA则因它的一些特异性位点常常由于其中的一个碱基的甲基化被保护起来,使
2、此位点不再成为限制酶的底物。限制性内切酶是基因工程技术中不可缺少的工具，也称为工具酶。,限制性内切酶的高度特异性与反应条件有关。每种酶都要求最适合的反应条件，如缓冲液和甘油浓度等，当这些条件改变时，某些酶的识别序列将改变。限制性内切酶多保存在甘油之中，商品酶制剂一般含有50%的甘油，它起着稳定酶活性的作用。而在酶反应体系中，甘油量太大会抑制酶的活性。为此，要求一般酶甘油制剂的使用量应小于反应体系体积的10%。例如反应体积为20l时，使用的酶制剂不可大于2l。一般限制性内切酶的反应缓冲液要求有三种基本物质：Tris-Hcl（pH7.5）、MgCl2和NaCl。不同酶需要这三种物质在缓冲液中的浓度
3、各不相同。DTT（二硫苏代糖）或用-巯基乙醇，主要起保护酶活性的作用。,反应体系中限制性内切酶的用量与如下两方面有关系：（1）DNA的分子量：酶切相同重量的DNA，分子量大的，分子数就少，所以使用的酶 量就少些，因而酶用量与DNA的分子量成反比。（2）酶切位点的多少：在DNA分子中切口多的酶，因每个切口都需要酶作用，因而酶 的用量就相对多些，切口少的酶则用量就相对少些，所以酶用量与DNA分子上的 切口数成正比。,2、限制性内切酶消化质粒DNA的反应 本实验用BamHI 和HindIII 酶“切割”质粒pMD18-T-kfNHX。已知pMD18-T-kfNHX 质粒上只1个BamHI 和Hind
4、III 酶切口，kfNHX 的碱基序列长为约1700bp,被酶切后，出现两条带在琼脂糖凝胶电泳图谱中可以观察到。,3、材料与仪器3.1 质粒：根据具体情况而定；3.2 限制性核酸内切酶BamHI 和HindIII；3.3 微量加样器；3.4 EP管；3.5 水浴锅或37C培养箱；3.6 电泳设备；3.7 凝胶成像系统4、试剂与配制20ul反应体系：10K buffer 2l，BamHI 0.5l，HindIII 0.5l,sample:根据质粒样品的浓度加8l，加水补足20l 37C反应 3-4小时。0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，照相贮存,5、思考题：1.影响酶切结果的主要因素有哪些，请正确分析你的实验结果。2.限制性内切酶可用于分子生物学的哪些方面？,图1.-扩增产物的凝胶电泳图谱 Fig.1 Amplification of KfNHX by RT-PCR from Kalidium foliatum cDNA 1:DL2000+15000 marker 2:KfNHX,
