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1、第五章 分子生物学的常规技术（六）DNA文库的构建 和目的基因的筛选,基因文库：也称DNA文库，是指某一生物体全部或部分基因的集合。某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库(gene library)。,基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。即 Genomic library,基因文库:外源DNA片段 载
2、体 宿主 等3个部分组成。,构建基因文库的基本程序：提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；阳性重组菌落或噬菌斑的选择。,基因文库(外源DNA片段的来源)分为：基因组DNA文库(genomic DNA library)cDNA文库(complementary DNA library),基因组DNA文库:是指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获
3、得的所有阳性菌落。将庞大的基因组分解成许多片段，每段包含一个或几个基因。,cDNA文库:cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因群体。由于基因表达具有组织和发育时期特异性，因此cDNA文库所代表的基因组具有同样的时空特性，它仅包含所选材料在特定时期里表达的基因，并不包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。,基因组文库与cDNA文库最大的区别：cDNA文库有时空特异性。,cDNA文库反映了特定组织(或器官)在某种特定环境条件下基因的表达谱，因此对研究基因的表达、调控及基因间互作是非常有用的。不包含基因间隔序列、内含子及基因的调控区 基因组文库包含了
4、基因的全部信息，如编码区及非编码区内含子和外显子、启动子及其所包含的调控序列等,常用的文库筛选方法有：核酸探针杂交法 抗体免疫法 差异杂交法。,必须根据所研究基因的各种信息，如表达丰度、蛋白质特性和DNA序列等，以及基因文库的特点和类型选择适当的筛选方法。,一、载体的选择,第一节 基因组DNA文库的构建,可装载的外源DNA Plasmid 10kb Phage 0-23kb Cosmid 45kb BAC 100kb YAC 300kb-1.2Mb Pl噬菌体载体 P1人工染色体载体(PAC)。,粘粒克隆所需的克隆子数是 phage的一半，如需700000时，cosmid需350000个 因c
5、osmid在构建文库和贮存文库比phage困难得多，如无特殊需要(如单个phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid。,YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组,二、基因组DNA文库的类型,1质粒文库 质粒是最早用于构建基因组文库的载体，现已发展了数十种适用于基因克隆、表达和测序等不同目的的质粒载体。质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在10kb以内。这类基因组DNA文库一般应用于“鸟枪法”全基因组测序研究利用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。,2噬菌体文库 噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生
6、的一系列载体系统构建的；常用的有噬菌体载体，M13单链噬菌体载体，P1噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体(phagemid或phasmid)。M13载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建cDNA文库或BAC和PAC亚克隆文库。噬菌体文库中应用最广的是噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用噬菌体构建的基因组DNA文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要的作用,phage vectors早期（70年代后期）使用，如Charon 4A 和 gt-WES，克隆1520kb,目前用EMBL系列,2001，DASH，Charon 38-40，GEM-11 等置换型载体，插入片段的最大值可达20-
7、24kb,3.黏粒文库 黏粒又称柯斯质粒，是由噬菌体的cos序列、质粒的复制序列和抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。黏粒载体主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。有时也用于构建大基因组物种的基因组DNA文库，利用它们的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段。,4.人工染色体文库 包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和P1人工染色体文库。又称大片段基因组DNA文库，容纳外源DNA片段为100kb-1Mb.用于大基因组物种基因克隆、物理图谱构建和基因组测序。,5.亚基因组文库 文库对象是基因组的某一区段。1）通过Southern杂交可以判断
8、出携带目的基因的DNA片段大小，此时可以利用内切酶对基因组DNA进行消化并回收这一大小的DNA片段来构建文库进行基因的筛选；2）利用原位杂交等技术将基因定位于某一条染色体，然后通过显微切割的方法分离单条染色体来构建亚基因组文库；3）先将基因定位于一个YAC或BAC克隆，再构建该克隆的亚基因组文库 一般而言，亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种基因克隆或大基因组物种的后期研究。,6 基因组文库的发展 90年代，一些高等真核生物基因组研究计划启动，建以大片段克隆重叠群为基础的染色体物理图谱 由于构建果蝇、拟南芥以及人等的染色体物理图谱的需要，先后发展了多种可容纳大片段的克隆载体，如YAC、P1、
9、BAC和PAC，它们可以容纳701000 kb的外源DNA片段 由于具有装载的外源DNA片段大，操作方便、很少出现嵌合现象等优点，BAC利PAC是目前基因组研究中最为常用的两种载体 在植物基因组研究中，往往需要构建含目的基因的大片段DNA的亚克隆文库，再从中分离出含目的基因的亚克隆并转化植物，验证目的基因的功能。为加快研究速度，省去构建亚克隆文库和筛选亚克隆的麻烦，现在已发展了一些可直接转化植物的大片段文库载体如BIBAC和TAC等，这些载体都包含转基因所需的T-DNA序列,三、文库的代表性和随机性,代表性：文库中所有克隆所携带的DNA片段可以覆盖整个基因组，可以从该文库中分离任何一段基因组D
10、NA 代表性是衡量文库质量的一个重要指标。,提高文库的代表性的策略：一是采用部分酶切或随机切割的方法来打断染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段基因组DNA在文库中出现频率均等；二是增加文库的总容量，提高覆盖基因组的倍数。文库总容量由外源片段的平均长度和重组克隆的数量共同决定，外源片段的长度受所选用的载体体系限制从经济的角度考虑，重组克隆的数量并不是越多越好，因此选用一个合适的重组克隆数量是很有必要的。,1976年Clark and Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p:所期望的目的基因在基
11、因文库中出现的几率 f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值,哺乳动物 3109kb若p=99%平均克隆片段20kb f=20kb/3109 n=690773.2,E.coli 4639221bp p=99%f=20kb/4600kb n=1056.9,p=99%f=10kb/4600kb n=2116,四、基因组DNA文库的构建流程,基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：载体的制备；高纯度大相对分子质量基因组DNA（HMW DNA)的提取；HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞 重组克隆的挑取和保存,1基因组DNA文库的载体制备 制备的载
12、体要求纯度高、去磷酸化效果好。载体去磷酸化是为了提高连接效率，在同一个连接组分中，载体自身连接速度远大于与外源片段的连接速度。如果载体去磷酸化不彻底，会出现大量不含外源片段的克隆，严重影响文库的质量。如果载体纯度不高，含有大量细菌基因组DNA，则会出现大量的插入片段为细菌基因组DNA的假阳性菌落，也影响文库的质量,BAC类载体：拷贝数低，难于提取足量的质粒；近年来发展了多拷贝的BAC载体(如pCUGIBACl等)，它将pBeloBACll载体和常用的多拷贝载体pBluescript融合在一起，而构建的文库质量没有区别。插入片段大，去磷酸化的要求也更严格。以BAC载体pBeloBACll为例，要
13、构建一个高质量的文库，需要1mg左右的质粒用于氯化铯梯度离心分离超螺旋状态的组分，至少要从14L处于对数生长期的培养物提取质粒才能满足需要,2.高质量大相对分子质量基因组DNA的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA相对分子质量要求不同，一般所提取的DNA相对分子质量至少应该是文库最终平均插入片段长度的35倍。提取的基因组DNA相对分子质量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。,真核生物基因组DNA提取方法有：液相法 固相法。,液相法：如CTAB法，可以提取100kb左右的DNA，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。固相:大相对分子质量(HMW)基因组DNA提取方
14、法很复杂，一般采用的是在固相环境下对游离的单个细胞进行操作，避免了移液和摇动等造成的剪切力，保护了DNA的完整。大相对分子质量DNA提取方法，利用了低熔点琼脂糖包埋固定的方法。将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶中，并浸泡在含有EDTA的缓冲液中。在这种包埋状态下对细胞进行破壁、去除蛋白和杂质、清洗，之后进行酶切反应。,大分子DNA提取有2个主要步骤：第一是将提供的材料制备成单个细胞的悬浮液 第二是将DNA包埋并且纯化出HMW DNA。除于DNA被固定之外，包埋在低熔点琼脂糖中的HMW DNA的部分酶切反应和普通的部分酶切没有什么不同。酶切后的DNA要经过分级分离，大片段基因组DNA文库主要是通过PF
15、GE法回收对应大小区段的DNA，小片段基因组DNA文库则常用蔗糖密度梯度离心法回收酶切的DNA。,3.外源DNA的连接转化或包装侵染 连接反应是将部分酶切后回收的DNA同载体在T4 DNA连接酶的作用下连接在一起的过程。在连接体系中同时存在着至少4种连接方式：载体自连 载体和基因组DNA片段之间的连接 基因组DNA片段的自连 基因组DNA片段之间的连接。,提高连接效率是关键：在连接酶、载体和外源基因组DNA已经确定，可通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果 在构建大片段基因组DNA文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在转化和包装侵染过程中，最好选择转化效率高的感受
16、态细胞和最佳的转化条件或效价高且质量稳定的包装蛋白。,4文库的质量检测 文库质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素决定的。克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量就越好。在实际应用中，克隆数目可以通过多次转化累加。但并不是越多越好，只要达到一定的基因组覆盖倍数和覆盖度就行，一般要求达到46倍覆盖率,在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其他值都是估算的 文库的平均插入片段长度是通过PFGE电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。对于大片段文库而言，平均插入片段大小是衡量文库质量的一个重要依据。对BAC
17、文库，一般要求植物的片段在130kb左右，而动物的片段在150kb左右。插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的克隆中所占的比例，也是通过此法检测的。,基因组覆盖倍数的估算方法有2种：一种是用公式计算：基因组覆盖倍数平均插入片段长度克隆数基因组DNA的长度(一般是约数)；另一种是结合基因组覆盖度的检测来估算。,基因组覆盖度：是指文库中的克隆覆盖基因组的范围；选择一定数目的单拷贝基因作探针来筛选文库，如果所有探针都可从文库中检测到阳性克隆，则说明该文库覆盖度很高。每个探针筛选的克隆数目即为该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数除以使用的总探针数。,第二节 cD
18、NA文库的构建,一、cDNA文库的特征和发展 将来自真核生物的mRNA体外反转录成cDNA，与载体连接并转化大肠杆菌的过程，称为cDNA文库的构建。真核生物基因组大，结构复杂，含有大量的非编码区、基因间间隔序列和重复序列等，直接利用基因组文库有时很难分离到目的基因片段。即使分离到DNA片段，也必须同其cDNA序列进行比较，从而确定该基因的编码区、非编码区、翻译产物和调控序列。,mRNA是基因转录加工后的产物，不含有内含子和其他调控序列，结构相对简单，且只在特定的组织器官、发育时期表达因此，在某些情况下从cDNA文库分离基因比从基因组文库中分离基因更具优势 mRNA决定了功能蛋白的初始肽链的翻译
19、，可以用来研究蛋白质的功能 自20世纪70年代中期首次合成cDNA以来，运用cDNA文库进行基因克隆和基因功能研究发展很快，cDNA文库巳成为分子生物学研究的一种基本工具。,基因的表达具有时空性和表达量上的差异：时空性取决于cDNA文库的取材。构建cDNA文库时最好选取目的基因表达最高的发育时期或这一时期的特殊组织。表达量的差异决定了构建的cDNA文库要具有合适的容量。在一定时期的单个细胞中，约有500,000个mRNA分子，可能代表了l-2万个基因。,1.mRNA的完整性,指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞）哺乳动物总mRNA可编码 10100kDa蛋白 指导合成目
20、的多肽的能力 利用免疫沉淀和SDS-PAGE mRNA的大小 500bp8kb 大部分 1.52kb,2.mRNA分成3类：高丰度 中等丰度 低丰度mRNA.,高丰度的mRNA:约有几十种，每个细胞中可能含有5000个拷贝;中等丰度的mRNA分子:可能含有10002000种，每个细胞含有约200-300个拷贝；低丰度的mRNA:种类最多，但每个细胞仅含有115个拷贝左右。,3mRNA的富集 按大小对mRNA进行分级分离 分离不同大小的mRNA（先变性，如氢氧化甲基汞，后梯度离心，蔗糖）体外翻译，检测每份中的比活,cDNA的分级分离 近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA,ag
21、arose分离大小易辩,多聚核糖体的免疫学纯化法 用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体 免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo(dT)层析分离mRNA。此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%并非都可用，根据材料、来源、特异性来选择,根据计算公式，如果要从文库中筛到每个细胞只含1个mRNA分子的基因(期望值p0.99)，cDNA文库应包含5,000,00010,000,000个重组子，而对于高丰度或中等丰度基因,文库包含105个克隆子。早期的cDNA文库多以噬菌体
22、为克隆载体，主要用于筛选单个目的基因。,cDNA文库可获得表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，研究特定器官、组织或发育时期基因的表达谱发现新基因。如果能降低高丰度和中等丰度基因在文库中的冗余度，同时提高低丰度基因在文库中的代表性，就可大大降低高丰度和中等丰度基因在EST中的重复次数，提高发现新基因的效率，大大降低cDNA测序的成本 为达到这个目的，近年来发展了均一化cDNA文库、差减杂交cDNA文库和选择性分离全长cDNA等技术。,均一化cDNA文库(normalized cDNA library):是通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定的
23、处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致,在经过均一化处理的cDNA文库中，前两种类型mRNA分子对应的cDNA克隆的比例之和仅为4.6，相当于降低了13.5倍，低丰度基因在文库中的比例高达95.4，相当于提高了2.5倍 在EST测序和cDNA芯片的研究中，可以大幅度降低成本，相对提高一些极低丰度基因出现的频率。随着越来越多物种的全基因组测序的完成，需要借助全长cDNA序列进行基因预测和功能注释，所以近年又开发了多种全长cDNA文库构建技术。,二、cDNA文库的构建,cDNA文库的构建共分4步：1.细胞总RNA的提取和m
24、RNA分离;2.第一链cDNA合成;3.第二链cDNA合成;4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。,1RNA的分离 mRNA是构建cDNA文库的起始材料总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1-5，mRNA的含量取决于细胞类型和细胞的生理状态。在单个哺乳动物细胞中，大约有360000个mRNA分子，约12000种不同的mRNA，有些mRNA分子占细胞mRNA的3，而有些mRNA分子只占不到0.01这些“稀有”或“低丰度”mRNA分子多达11000种，在每个细胞中只有5-15个分子，占基因总数的45 由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA
25、中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。,真核生物mRNA的3末端都含有一段poly(A)尾巴，纯化mRNA的方法都是在固体支持物表面共价结合一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸oligo(dT)链，oligo(dT)与mRNA的poly(A)尾巴杂交，将mRNA固定在固体支持物表面，进而可将mRNA从其他组分中分离出来的。由于oligo(dT)链和poly(A)都不长，杂交可形成的杂合双链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分开，利用这一性质从RNA组分中分离纯化出mRNA。,2 第一链cDNA
26、的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录酶催化常用的反转录酶有2种:AMV(来自禽成髓细胞瘤病毒)(42)RNase H Mo-MLV(来白Moloey鼠自血病病毒)(37)RNase H弱 长mRNA 二者都是依赖于RNA的DNA聚合酶有53DNA聚合酶活性。目前常用的反转录酶多是通过点突变去掉了RNase H活性的Mo-MLV。,反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶，合成DNA时需要引物引导。常用的引物主要有oligo(dT)引物和随机引物。oligo(dT)引物一般包含15-30个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡核苷酸片段随机引物,一般是包含6-10个碱基的寡核苷酸
27、短片段。oligo(dT)引导的cDNA合成是在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物，oligo(dT)引物与mRNA 5末端的poly(A)配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍。由于cDNA末端存在较长的poly(A)，对后续的cDNA测序产生一定影响,随机引物引导的cDNA合成是采用6-10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点 由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的5端序列。由于随机引物法难以合成完整的cDNA片段，因而
28、不适合构建cDNA文库，一般用于RT-PCR和5-RACE.,3 第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。,cDNA第二链合成的方法大致有4种:自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物-衔接头合成法,(1)自身引导合成法 首先用氢氧比钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3末端就会形成一个发夹环(发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，据推测可能是与帽子的特殊结构相关)，并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1核酸酶将连接处(仅该位点处为单链结构)切断形成平端结构。
29、这样的处理要求很高纯度的Sl核酸酶，否则容易导致双链分子的降解从而丧失部分序列 1982年前，自身引导合成法是cDNA合成中的常用方法，但由于S1核酸酶的操作很难控制，经常导致cDNA的大量损失，现已经不常使用,(2)置换合成法 置换合成法是由一组酶共同控制，包括RNase H，大肠杆菌DNA聚合酶I和DNA连接酶。在mRNA-cDNA杂合双链中，RNase H在mRNA链切出很多切口产生很多小片段，大肠杆菌DNA聚合酶I以这些小片段为引物合成第二链cDNA片段这些cDNA片段进而在DNA连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA的第二链。遗留在5末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶I
30、的53外切核酸酶和RNase H降解暴露出与第一链cDNA对应的3端部分序列。大肠杆菌DNA聚合酶I的35外切核酸酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这种方法合成的cDNA在5端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整,有效 无须进一步纯化 不需用S1酶，否则会导致cDNA的大量损失,问题：如何脱帽以便进入载体 5端cDNA不能合成（少几个Nt）有可能仍形成发夹结构,(3)引导合成法 制备一端带有poly(dG)的片段II和带有poly(dT)的载体片段I;用片段I来代替oligo(dT)进行cDNA第一链的合成 在第一链cDNA合成后直接采用末端转
31、移酶在第一链 cDNA的3端加上一段poly(dC)的尾巴 用限制性内切酶创造出一个黏性末端，与片段II一起形成环化体 环化了的杂合双链在RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶I和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA,主要特点：合成全长cDNA的比例较高缺点：操作比较复杂，形成的cDNA克隆中部带有一段poly(dC)/(dA)，对重组子的复制和测序都不利,(4)引物-衔接头合成法 由引导合成法改进而来的。第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶在第一链cDNA的3端加上一段poly(dC)的尾巴，dC后用一段带接头序列的poly(dG)短核苷酸链作引物合成互补的cDNA链，按头
32、序列可以是适用于PCR扩增的特异序列或方便克隆的酶切位点序列。这一方法目前已经发展成PCR法构建cDNA文库的常用方法。,4双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖 由于平端连接的效率低，双链cDNA在和载体连接之前，要经过同聚物加尾、加接头等一系列处理，其中添加带有限制性酶切位点接头是最常用的方法。,添加带有限制性酶切位点接头有两种方式:1)是添加单酶切位点接头 在第一链cDNA合成时不引入接头，而直接在第二链上通过平端连接导入接头。当导入的黏端接头已经去磷酸化，则可以在分级分离后直接用于连接 当导入的黏端接头带有活性磷酸基团时，要求接头带有对甲基化敏感的限制性内切酶，且加接头
33、之前须对双链cDNA进行甲基化修饰以免被限制酶切割，加接头后再用接头带有对甲基化敏感的限制性内切酶消化双链cDNA，创造黏端用于连接。,2)是在cDNA的5和3末端分别引入不同的限制性内切酶位点 在第一链合成时在cDNA的5端引入一稀有酶切位点(如Not I)，在双链cDNA平端连接去磷酸化的黏端接头(如Sal I)，然后用Not I酶切创造出另一端的黏端，这样可以与对应双酶切载体连接双酶切法连接的cDNA插入方向是固定的。,双链cDNA在连接之前最好经过cDNA分级分离，回收大于500bp的cDNA用于连接。在未处理的双链cDNA中，有很多小于500bp的分子，包括引物、接头以及反转录产生的
34、各种不完整的cDNA产物，这些组分都会影响cDNA文库的质量，如造成很多假阳性的重组子，重组子的插入片段太小。分级分离最简单的、应用最广的是层析柱法，它可以方便快速地去除组分中小于500bp的分子，提高文库的质量,cDNA文库的载体选择 因为一般cDNA的长度范围多在0.5-8kb之间，常用的质粒载体或噬菌体类载体都能满足要求。一般而言，噬菌体cDNA文库比质粒文库筛选方便，如单个培养皿内可以铺展更多的重组子，复制用于杂交的膜方便快捷，杂交背量低等。但质粒文库在后续操作上更加方便且用途更广。,三、cDNA文库均一化处理 构建均一化cDNA文库上要看两条途径：1)基因组DNA饱和杂交法 2)基于
35、复性动力学原理的均一化。,1基因组DNA饱和杂交法 尽管细胞内mRNA的丰度差异很大，但是编码这些mRNA的基因在基因组中对应的拷贝数却不存在差异或差异很小(极少数在基因组中存在很高拷贝的基因除外)。利用不同表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对一致的特点，可以对cDNA文库进行均一化。,该方法包含3个部分：将基因组DNA用限制性内切酶消化固定，消化后的基因组DNA变性为相对较短的单链且最大可能地覆盖基因组 分离纯化独立cDNA文库的混合质粒；文库DNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定住相应的cDNA，并将它洗脱重新转化受体菌,理论上，通过cDNA与基因组DNA的饱和杂交，基因组DNA上结
36、合的cDNA克隆的数目是一致的重新转化后，它们在文库中出现的频率基本相近。该法应用起来非常简单，且没有仪器上的限制，具有很好的均一化效果。,该法也有不足:一是由于基因组DNA相对复杂，很难获得覆盖基因组的单链DNA片段，导致文库内基因的丢失 采用不同的限制性内切酶消化基因组DNA，构建两个独立、互补的均一化文库可以一定程度地弥补上述不足。二是在基因组DNA与文库DNA杂交的过程中，文库DNA自身杂交的速度会很快，导致基因丢失 将cDNA文库制备成单链后再与固定的基因组DNA杂交来克服这一不足,2基于复性动力学原理的均一化方法 双链DNA在加热变性后再复性形成双链DNA的速率遵循二次复性动力学原
37、理。与组分中的单链DNA的浓度相关，浓度越小，复性所需的时间越长。cDNA文库中高丰度cDNA复性所需的时间较短，低丰度cDNA复性所需的时间较长。通过控制复性时间可使高丰度cDNA复性成双链状态，而低丰度cDNA仍保持单链状态 利用羟基磷灰石柱很容易将单链和双链cDNA分开。再用得到的单链cDNA转化宿主细菌，即可得到均一化cDNA文库。,主要优点:几乎不会导致起始文库中cDNA的丢失;均一化的效果更为明显.不利:操作更为复杂 受多参数控制，需要多次的尝试与摸索方能成功。目前，基于这两种原理的均一化处理方法应用非常广泛，数据库有越来越多的EST序列来自均一化文库。,四、扣除杂交cDNA文库
38、在某些情况下，目的基因在特定发育时期的器官或组织、在一定环境下特异表达。这些基因表达量很低，从普通的cDNA文库或均一化文库中筛选起来很难。扣除杂交文库是在扣除杂交基础上构建的cDNA文库。,扣除杂交技术(subtractive hybridization)：是将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本(tester)将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的mRMA群体作为对照样本(driver)将tester和driver的cDNA进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留二者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达基因的可能性也大大提高
39、。,扣除cDNA文库技术有以下2种：1.抑制性扣除杂交 2mRNA-cDNA杂交,1.抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)Diatchenko.L等于1996年提出了一种可以有效克服基因上调表达所造成不利后果的克隆基因的新方法抑制性扣除杂交（SSH）。该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA。从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。而所谓抑制PCR，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无
40、法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。其具体过程第一步与RAD相同，酶切后得到Tester与Driver样本的平末端cDNA片段。,过程：首先，含目的基因的cDNA称为“供体(tester)”，不含目的基因的cDNA称为“驱动”(driver)，它们是由对应的mRNA组分在体外独立反转录而来 同时利用识别4个碱基的限制性内切核酸酶Rsa I将这些cDNA消化成平末端的小片段。将供体一分为二，分别加上2种不同的接头(接头1和接头2)。在第一轮杂交中，用过量的驱动cDNA分别与带2种不同接头的供体cDNA杂交，在2个独立的杂交体系中，供体与驱动cDNA就会形成4种类型的cDNA片段
41、。,其中：a代表供体中既没有与供体杂交，又没有与驱动杂交的cDNA分子，这些cDNA一般浓度很低，不能和与自己互补的链杂交：b代表供体中自身杂交的cDNA分子；c代表供体和驱动中共同表达的基因杂交形成的双链cDNA分子，d代表驱动中自身杂交和不能与自身或供体杂交的cDNA分子，如同供体的a和b。整个杂交(复性)过程遵循复性动力学原理，由于驱动浓度远大于供体的量，供体中与驱动同源的cDNA理论上全部形成了类型c，而a中所聚集的主要是差异表达的基因。,然后进行第二轮杂交：将第一轮杂交的两个体系混合，再加入过量的驱动cDNA，进行第二轮杂交。杂交的结果会进一步形成a、b、c和d，同时带不同接头的a会
42、复性形成新类型e。将第二轮杂交的产物进行末端补平，再进行两轮PCR扩增。在PCR扩增过程中，由于a和d没有引物结合位点而不能被扩增，由于b的两端带有相同的接头序列，大多数的b会形成锅柄结构而不能进行指数扩增；c只有1个引物结合位点，只能被线性扩增只有e带有2个不同的引物接头，可以进行指数扩增只有e是均一化的、差异表达的基因接着用巢式引物进行第一轮PCR，降低PCR产物的背景富集差异表达的基因。最后，将第二轮PCR产物用T/A克隆载体进行克隆构建扣除杂交cDNA文库。,第一次PCR是基于其抑制效应，只有两端分别是接头1和接头2的具差别表达的序列片段得以指数扩增。第二次PCR极大提高扩增的特异性，
43、使得差异表达的目的基因片段得到大量富集，并可用于后续的筛选工作。,SSH优势主要表现在:1)极大降低了假阳性率 由于SSH方法采用两次扣除杂交和两次PCR,保证了该方法具有较高特异性。据有关报道证明SSH方法假阳性率可降至6%;2)具高度灵敏性 由于在反应中将丰度不同的单链分子含量归一化,保证了低丰度mRNA检测成功;3)SSH法在一次反应中,可同时分离出上百个差异表达的基因,这一点远胜于DDRT-PCR和RAD。而其缺点与RAD类似。,2mRNA-cDNA杂交 mRNA-cDNA杂交方法的原理是用过量的驱动mRNA与供体的cDNA文库质粒反复多轮杂交，去除驱动和供体共同表达的基因，构建均一化
44、的、扣除杂交cDNA文库。,先用多克隆位点顺序相反的质粒载体分别构建供体和驱动的cDNA文库 然后提取供体cDNA文库的混合单链质粒，同时提取驱动cDNA文库的质粒 利用生物素标记的引物和T7 DNA聚合酶(或SP6 DNA聚合酶)，以驱动cDNA文库的混合质粒为模板在体外转录出对应的mRNA(末端生物素标记),然后，将过量的驱动mRNA与供体cDNA的单链质粒杂交，二者共同表达的基因通过杂交形成cDNA-mRNA杂合双链，进而可以通过结合了生物素抗体的磁珠将杂合子去除，保留供体中特异表达的，没有杂交的单链质粒DNA。经过如此多轮杂交，尽可能多地去除驱动和供体中共同表达的基因，富集供体中特异表
45、达的cDNA。最后，将没有杂交的单链质粒转化大肠杆菌即得到扣除杂交的cDNA文库。,抑制性扣除杂交系统主要依赖PCR反应过程，不涉及到体外反转录和纯化的过程，操作起来相对简单，而且已经有商品化的试剂盒。但该系统相对比较复杂，尤其杂交的过程非常灵敏，稍不注意就会导致构建的差异文库中出现大量的“假阳性”克隆，而后一种方法可以通过多次的杂交来克服这一缺点 另外，抑制性扣除杂交文库中的cDNA是打断了的片段，一般在200800bp之间，而后一种方法获得的cDNA相对比较完整,五、全长cDNA文库（重点）,全长cDNA在基因克隆和基因功能定性研究中有很重要的作用 但用置换合成法、引导合成法以及引物-衔接
46、头法构建的cDNA文库中，全长cDNA克隆的比例比较低;因此提高cDNA文库中全长cDNA比例即构建全长cDNA文库（full-length cDNA library)就显得非常重要,导致cDNA不完整的原因：1.cDNA第二链合成过程中聚合酶的外切核酸酶活性。2.mRNA的降解 mRNA很容易从5端开始降解，涉及的因素有很多，包括起始的生物材料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断裂等 3.反转录酶的合成特性 即便是去除了RNase H活性的反转录酶在反转录全长的mRNA时，其合成的也是全长和非全长反转录产物的混合物这一方面与mRNA分子的结构有关，也与反转录酶从转录复合体上脱落有关。,
47、要想构建真正意义上的全长cDNA文库，不仅要考虑如何确保第二链的完整合成，还要考虑如何避开反转录或mRNA本身的影响。从理论上分析，如果有一种方法能够在合成cDNA之后对全长cDNA进行选择，就可以大幅度提高全长cDNA克隆的比例。,1SMART全长cDNA文库的构建法 在第一链cDNA合成时，由于反转录酶带有末端转移酶的活性，当其到达mRNA 5端时会自动在第一链cDNA的3末端加上几个d(C)。加入带有3个d(G)的特异性引物，该引物会与全长cDNA第一链互补结合，然后继续以该引物为模板合成互补链。,1)全长cDNA的比例得到大幅提高。2)错配造成假全长cDNA的可能性较大 所以该法还不是
48、理想的全长 cDNA文库构建的方法 由于其已经商品化，操作起来方便，目前应用非常广泛。,2.Cap-Trapper法构建全长cDNA文库 生物素标记和甲基化标记。首先利用3带锚定碱基的oligo(dT)12引物引导合成第一链cDNA。合成第一链cDNA时用dm5CTP代替dCTP，使所有的胞嘧啶都被5-甲基-dCTP取代以保护cDNA不被随后的限制性内切酶消化。其次在mRNA的5和3末端标记上生物素，并用RNaseI消化单链RNA。由于全长第一链cDNA与mRNA形成的杂合双链分子中不存在单链mRNA，而不完整的第一链cDNA与mRNA形成的杂合双链分子中mRNA的5末端仍然处于单链状态，可用
49、RNase I将单链部分的mRNA消化掉，从而也将标记的生物素切割掉,然后利用偶联了生物素抗体的磁珠分离出生长的cDNA-mRNA杂合双链，水解mRNA链后再利用加尾法在第一链cDNA末端加上oligo(dG)，并合成第二链cDNA。最后用合适的限制性内切酶消化双链cDNA，与载体连接，包装后感染大肠杆菌即可以获得全长的cDNA文库。利用这种方法构建的全长cDNA文库中有88.1%-95%的克隆包含子ATG；,3.烟草酸焦磷酸酶法构建全长cDNA文库 烟草酸焦磷酸酶(TAP)能特异地识别真核生物mRNA的5端帽子结构并将其去除，暴露出切口5端的磷酸基团，可以在该切口处连接一段特异的接头来引导c
50、DNA第二链的合成。在反转录合成第一链前对mRNA进行去磷酸化处理，使不完整的mRNA分子中暴露的5端磷酸被去掉；然后在反应中加入TAP，特异性地去掉完整mRNA分子5末端的帽子结构，暴露出5端磷酸基团。在T4 RNA连接酶的作用下，可以在5端连接上一段特异的RNA接头不完整的mRNA分子中由于缺少磷酸基团而不能连接上接头，因此只有添加了接头的全长mRNA分子才能在该接头引导下合成第二链cDNA合成.,理论上讲，用此方法合成的cDNA都是全长的cDNA。在cDNA第二链合成时，可以通过对应RNA接头的序列和oligo(T)中序列，设计引物作巢式PCR将完整cDNA扩增出来。,六.其他cDNA文
