分子生物学载体.ppt

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1、第四章 基因工程载体,载体（Vectors）在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。载体是DNA双链分子。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可转入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA共同扩增。,载体的功能,1.为外源基因提供转入受体细胞的转移能力；2.为外源基因提供在受体细胞中的复制或整合能力；3.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达提供必要的条件能力。,理想载体至少必备的条件,能在宿主细胞中自主复制 容易进入宿主细胞 容易插入外来核酸片段 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 具有合适的筛选标记 具有针对受体细胞

2、的亲缘性或亲和性（可转移性）,目前的主要载体,质粒（Plasmid）单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（Cosmid）动物病毒（virus）细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC),大肠杆菌的质粒,独立于染色体以外的能自主复制、并能被稳定遗 传的一类双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。分子量：1-300 kb。编码基因少：23个中等大小的蛋白质。如：抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的 特性（非必须）。环形状：双链环状DNA。,质粒（plasmid）,质粒DNA的空间构型,SC构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形 结构，DNA呈现超螺旋。O

3、C构型:两条链中只有一条保持着完整的环 形结构，另一条链出现缺口，称之 为开环DNA。L 构型:DNA双链均发生断裂而形成线性分 子。,质粒空间构型与电泳速率 分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。,1.1 质粒的生物学基本特性,1.自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。,2.生物不相容性（Incompatibility）有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。同群质粒含有相似复制子结构的不

4、同质粒。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒的生物学基本特性,质粒的不相容性分子机制,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,3.可转移性 部分质粒含有tra基因，

5、指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。4.稳定性 质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。5.寄生性 质粒只能在宿主的细胞内复制。6.可扩增性,质粒的生物学基本特性,7.携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,质粒的生物学基本特性,1.2 质粒的类型,（1）按转移性分 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒 能在天然条件

6、下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom 和mob 基因决定。,1.2 质粒的类型,（2）按复制机理分：严紧控制型质粒，松弛控制型质粒。严紧型复制质粒（stringent plasmid）严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，复制随细菌染色体的复制同步进行。特点：拷贝数少，只有1-3 拷贝（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。松弛型复制质粒（relaxed plasmid）松弛型质粒

7、的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，独立于细菌细胞而自主复制。特点：拷贝数多，通常有几十乃至几千份拷贝（非接合型 质粒分子量小，一般属松弛型）。作为载体的质粒应该是松弛型的,1.3 质粒的命名,用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。后面的数字是构建质粒的编号。如：pUC18和pBR322。,天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低，单一酶切位点少（2）筛选标志不理想 质粒载体必须具备的基本条件（1）具有复制起点（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因是筛选的标志 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。（3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA

8、片 段，且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。（5）易从宿主细胞中分离纯化。,1.4质粒载体的构建,加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。增加或减少合适的酶切位点，便于重组。缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。加装特殊的基因元件。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,1.4质粒载体的构建,人

9、工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产 物。（2）低拷贝数的质粒载体 不适合大量扩增DNA用。但有特殊用途。（3）温控的质粒载体（runaway plasmid vectors）这是一类温度敏感型复制控制质粒。温度低（低于37），拷贝数很少；温度增加（40）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。,（4）插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。,（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。目前通用的绝大部分

10、 质粒载体都是正选择载体。（6）表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因的整合。穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因能在两种不同的受体细胞中复制。探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件。,如何阅读质粒图谱,1.首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）2.再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）Tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）Camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失 去毒性。（

11、4）neor（Kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）Hygr 使潮霉素失活。,如何阅读质粒图谱,3.看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。4.再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。,如何阅读质粒图谱,5.是否含有表达系统元件，即 启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。,Universit

12、y of California 的 J.Messing 和 J.Vieria 于 1978年，在pBR322的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。2.8kb 元件来源 复制起点：pBR322的 ori Ampr 基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克 隆位点。lacZ基因：大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ 的氨基端片断。在lacZ 基因中有一段人工合成的含多 种内切酶的单一切点，在此位点上插入外源DNA都能 灭活下游lacZ基因。用于基因克隆和测序,1.5 经典的大肠杆菌质粒载体-pUC系列,克隆位点：10个连续的

13、单一限制酶切位点，位于lacZ 基因的5端。选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ 的 肽互补（蓝 白斑）相结合。,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖,异丙基-D-硫代半乳糖苷,噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一类细菌病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。,2 噬菌体载体,2.1 噬菌体的一般特性,T4 Bacteriophage,2.2.1 溶菌周期 烈性噬菌体（virulent phage)感染细菌后立即在菌体内复

14、制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2.2.2 溶原周期 温和噬菌体（temperate phage)感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。原噬菌体（prophage)：整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。,2.2 噬菌体的生活周期（有两种）,单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1、fd 噬菌体。,M13 噬菌体,2.3 单链噬菌体载体,2.3.1 单链DNA噬菌体的特点+DNA（ssDNA）。复制型（RF）是双链环状DNA。RF

15、DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生 噬菌斑。不存在包装限制。可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便 于作探针或测序。,2.3.2 M13 噬菌体寄主：大肠杆菌。DNA长度：6407 bp。外型:丝状组成:由外壳包装蛋白和正链DNA组成基因:至少有10个基因DNA提纯：RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有+DNA，也容易提取。M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,RF DNA:replicational form DNA,优点：,RF-DNA(复制型DNA)+DNA转译与包装相关的蛋白质 RFDNA达到200个拷贝时,+DNA被单链特

16、异的DNA结合蛋 白结合,阻断-DNA的复制只能以-DNA为模板复制新的+DNA 新的+DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体 颗粒,不断被挤出宿主细胞,M13 DNA载体的构建：,包装极限可达M13 DNA本身长度的7倍,M13系列载体的优点 有MCS，便于克隆不同的酶切片段 Xgal显色反应，可供直接选择 无包装限制，克隆能力大 可以克隆双链DNA分子中的每一条链。子代M13噬菌体 中包含的是单连+DNA。,噬菌体的生物学特性：生物结构 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成-DNA为线状双链DNA分子，全长48502个核苷酸，两端各有一个12核苷酸的

17、互补单链，称为cos区。-DNA-DNA上至少有61个基因，左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因。,2.4 双链噬菌体载体 载体,DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RF DNA）。,噬菌体载体的构建 野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。构建原理：删除噬菌体的非必需区，留出插入空间。在这个

18、非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体 删除DNA必须区段上常用的限制酶切点 噬菌体 DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：插入型载体 取代型载体,插入型载体长度36.4kb插入片断长度：0-14.5kb（36.4-51.9kb,替换型-DNA载体长度26kb插入片断长度：（36.4-51.9kb,-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的

19、两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,2.4.5 载体的体外包装,载体的体外包装,体外包装存在的问题 包装错误：既能包装内源性原DNA，也能包装重组的 DNA载体。重组：外源的重组DNA载体被诱发与内源性原DNA 发生重组。体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75%105%（3651kb）之间，即既不能超过正常野生型 容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%。注：野生型DNA的必须区是28kb，

20、所以载体的最大 克隆容量是23kb。（一般为15kb）。,以噬菌体为载体进行DNA克隆,DNA,用限制性内切酶除去中间一段,与外源DNA连接,重组载体的体外包装,带有外源DNA的噬菌体,太小不能被包装,2.4.6-DNA及其重组分子的分离纯化,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期加入噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，37培养1小时用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放-DNA乙醇或异丙醇沉淀-DNA,2.4.7-DNA载体的优点,-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌-D

21、NA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量重组-DNA分子的筛选较为方便重组-DNA分子的提取较为简便-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于构建基因文库，但不适合表达外源基因,3 cosmid载体（粘粒）,1978年，J.Collins和B.Hohn等人发展出 cosmid vector（cos site-carrying plasmid)大小：4-8kb 组成 DNA：cos序列和控制包装的序列。pBR322：质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点装载范围为31-45kb 多用于基因文库构建,cos:cohesive-end site,特点：,考斯质粒的构建,由

22、于-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构建的重组质粒，可装载外源DNA（45.5kb)，它仍可象-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。,cosmid vector的特点,具有噬菌体的特性 在寄主细胞内形成环化DNA 不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 克隆后可以体外包装成噬菌体颗粒。具有质粒载体的特性 能象质粒一样复制。方便的选择 有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。高容量的克隆能力 45kb（最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如

23、：DMD gene 2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。,4 人造染色体载体,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）,人造染色体载体,优点：能携带大片段DNA，约300kb。在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失

24、或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A,part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子FF质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300 kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库,

25、酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400 kb,酵母人工染色体（YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.22Mb,YAC 的主要功能成份有三：,1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成

26、线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,YAC酵母人工染色体 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。pYAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的基因工程。主要用于人类基因组研究和巨大基因如DMD基因达Mbp（106bp）数量级基因的克隆。,噬菌体PI载体和PAC,PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-PAC。,表达载体(expressing vector),特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列,哺乳动物表达载体,真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A)信号,