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1、第八章 基因操作技术及其应用,一、重组DNA技术,二、PCR技术,三、基因文库及分子杂交技术,克隆(clone)-无性繁殖分子克隆DNA的无性繁殖技术重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业二、重组DNA技术是基因工程的核心技术,一、重组DNA技术,重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术。它是基因工程的核心技术。,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞
2、，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。,DNA克隆定义,（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,重组DNA操作一般步骤：,（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中钓取目的基因。（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立全长cDNA文库或EST文库；从文库直接筛选所需基因。（3）根据同源克隆等原理克隆需
3、要的目的基因片段。（4）直接化学合成。,(一)、获得目的基因的方法：,(二)、限制酶的发现和应用则是DNA重组的关键,限制性内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称限制酶。是识别并特异性地切割双链DNA序列的一种核酸内切酶。（“分子手术刀”）发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,限制酶（“基因剪刀”）,根据其来源命名。如：属名 菌株名 E co R I 种名 编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。,命名,每种限制酶能识别和切割的
4、通常48个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。（回文结构）如：Hare III 5-GGCC-3 3-CCGG-5 Bam HI 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 平末端(blunt end)对称轴切，连接效果差切割形式 粘性末端（sticky end）交错切,切割形式,不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,根据上述限制酶的特点，在基因工
5、程和基因诊断中的重要用途：,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,（三）、基因转运载体及其选择,常用载体：质粒、噬菌体、粘粒、大片段克隆载体（BAC，YAC等）。,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,1、能自主复制；且插入外源DNA后，不影响其复制能力；2、具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；3、有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多
6、克隆位点；4、分子量小，以容纳较大的外源DNA；5、具生物安全性。,载体的选择标准,1.质粒(plasmid),2.-噬菌体(phage),置换载体 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。插入载体 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。,是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌。-噬菌体DNA是线状双链DNA分子，全长约50kb，每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装3752kb DNA分子。改建后的噬菌体发展了多种较大
7、型的克隆载体，如：,3.柯斯质粒(cosmid vector)：粘粒,是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos末端，全长8kb。可感染大肠杆菌。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装3050 kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。,4.其他载体：大片段DNA克隆载体,细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)约300kb噬菌体PI人工染色体（PI artificial chromosome,PAC）约100kb 酵母人工染色体(yeast a
8、rtificial chromosome,YAC)200kb 2000kb动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,（四）、外源DNA片断和载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal tra
9、nsferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,4.人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（五）重组DNA导入受体菌,感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。,转染（infection）：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒
10、噬菌体DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化。,转导（transduction）：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。,转化（transformation）通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。,（五）重组体的筛选(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法 原位杂交 Southern blot,四环素标记筛选,抗药标记,蓝白斑筛选,标志补救,重组DNA技术操作过程总结：,三、PCR技术：聚合酶
11、链式反应（polymerase chain eaction,PCR）,Kary B.Mullis,1993，Kary B.MullisPCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。,1)原理：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段。2)反应体系：DNA模板，引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer3)反应程序：变性(9495oC)退火 延伸(3755 oC)(7072 oC)72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍,PCR特点及应用,优点：（1）特异性强、
12、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析；（2）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息；（2）产物短小，DNA复制不精确。,四、基因文库与分子杂交技术,（一）、基因文库,基因组文库cDNA文库,（一）、基因文库,Southern blot,（二）、分子杂交技术,Northern blot,Western blot,基因组DNA文库（genomic DNA library）将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载（质粒或噬菌体）体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DN
13、A的集合称为G文库,（一）、基因文库,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组文库构建流程图,cDNA文库(cDNA library)以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。,C-文库具有组织细胞特异性。,组织或细胞RNA提取,反转录cDNA(double strand),克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,受体菌,cDNA文库构建流程图,cDNA lib
14、rary construction,（二）、分子杂交技术,分子杂交（molecular hybridization）：标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：DNA-DNA杂交（Southern blot）;DNA-RNA杂交（Northern blot）;蛋白-蛋白杂交（Western blot）。,1、基因探针（gene probe）,基因探针（probe）：是指与一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。,1）、探针标记 同位素：32P,35S,3H-d
15、NTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。,2）探针制备方法,缺口平移法（Nick translation）,随机引物法（Random primer）,末端标记法（Random primer）,Nick Translation,OH,p,OH+,P,P,DNA,dNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I,32P-dNTP Bio-dNTP,随机引物标记探针,5,3,5,5,3,DNA,32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primer,Klenow,dNTP变性-复姓,DNA末端标记,2、Southern blot,原理和步骤,提取T、Cell DNA,限制酶消化 DNA片段,电泳分离,变性转移至尼龙膜,变性、杂交,洗膜、放射自显影、结果分析,Southern blot,探针,Southern blot,2、Northern blot,原理和步骤,提取T、Cell 总RNA,提纯分离mRNA,凝胶电泳分离RNA,变性转移至尼龙膜,杂交,洗膜、放射自显影、结果分析,3、Western blot,原理和步骤,提取T、Cell 蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白,变性转移至尼龙膜,抗体杂交,Western blot,
