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1、第六章 色 谱,又称层析或色层分离。属高度纯化技术。初步纯化技术：超滤，离心，沉淀，溶剂萃取，膜分离，吸附等。高度纯化技术：选择性沉淀或结晶，电泳，络合，层析等。对药品，特别是注射用药品和基因工程菌生成的产品，都需要高度纯化。,气相色谱 液相色谱 特点分离精度高、设备简单、操作方便。应用物质成分的定量分析与检测；生物物质的制备、分离和纯化。,第一节 色谱原理与分类,一、原理,根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。,色谱系统的基本组成,生物分离主要用柱层析，柱层析处理量大。固定相分配系数大的后被洗脱。,二
2、、分类,流动相与固定相,固定相的形状,压力以固体为固定相的液相柱层析中，根据操作压力的不同分为：,流动相流动方向 轴向流层析 径向流层析优点：规模放大容易；柱效率高。缺点：柱设备造价较高。,分离操作方式根据分离操作方式不同分为:,洗脱展开（洗脱层析）料液中的溶质根据其在固定相和流动相间分配行为的不同，在层析柱出口处被展开形成相互分离的层析峰。,迎头分析（前流分析法）,将混合物溶液（料液）连续通过色谱柱，只有吸附力最弱的组分以纯品状态最先自柱中流出，其它各组分都不能达到分离。色谱峰呈阶梯式,顶替展开利用一种吸附力比各被吸附组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。顶替剂将料液中所含溶质按其与固定
3、相亲和力的大小不同从柱中次序顶替出来。,顶替展开,可以选用不同的洗脱方案,最简单的是无梯度洗脱：即在整个色层分离中，使用一种恒定组分的洗脱液（恒定的洗脱能力）。如果溶质的特性非常相似或非常不同这种形式的洗脱很少用，这种情况，有一些组分会快速洗脱而另一些会强烈地阻滞。采用梯度洗脱（阶梯式洗脱）：洗脱剂的洗脱能力可以连续或分段的提高。三种操作方法中，洗脱展开最常用。,分配机理根据溶质与固定相之间的相同作用机理，液相层析法可分为：,第二节 凝胶过滤层析,一、原理与操作,原理利用凝胶粒子（凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。操作一般采用恒定洗脱法，即采用组成一
4、定的洗脱液进行洗脱展开。,分子筛凝胶色谱原理,二、凝胶过滤介质,对凝胶过滤介质的要求亲水性高，表面惰性，即与溶质不发生任何化学或物理相互作用；稳定性高，对pH、离子强度及化学试剂稳定，使用寿命长；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力。,常用商品化凝胶过滤介质葡聚糖凝胶Sephadex G，传统的软凝胶过滤介质，目前仍广泛使用，但机械强度低。琼脂糖凝胶Sepharose，常用，但机械强度较低；Sepharose CL，用环氧氯丙烷交联制备，机械强度较高；此类凝胶经化学修饰后用于IEC、HIC和AC。,其他TSK凝胶，利用亲水性高分子合成制备，机械强度较高，经化学修饰后也常用于I
5、EC和AC；Superdex凝胶，将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖珠体上制备的刚性凝胶，分离精度高，用于高效液相层析；Superose凝胶，琼脂糖经二次交联制备的刚性凝胶，常用于高效IEC和AC。,凝胶特性参数排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。分级范围：可分离的溶质的相对分子量范围。溶胀率：溶胀后每克干凝胶吸收水分的百分数。,凝胶粒径：多用筛目或微米表示。粒径越小，分离效率越高。软凝胶粒径较大，硬凝胶粒径较小。床体积：1g干凝胶溶胀后所占有的体积。空隙体积：层析柱中凝胶之间空隙的体积。一般用水溶性蓝色葡聚糖（2000KD）测定。,三、应用及特点,应用分离纯化用于分离的
6、相对分子质量范围：几百到106。用于蛋白质、多肽、脂质、抗生素、糖类、核酸及病毒等生物物质的分离纯化。还可用于医药产业中无热原水的制备及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。,脱盐生物分离中主要用于生物大分子溶液的脱盐及除去小分子物质。还用于溶解目标产物的缓冲液的交换。凝胶主体还可以加入其它交换基团，如磺酸基，羧甲基，二乙基氨基乙基等，这些物质既有分子筛效应又具有一定的交换性能,Desalting proteins,proteins,salts,相对分子质量的测定在分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正比.m(v)=a-blgMr.故GFC可用于未知蛋白质相对分子质量的测
7、定。,特点优点采用恒定洗脱法，操作条件温和，收率接近100；介质不需清洗或再生，易实施循环操作，提高产品纯度；脱盐比透析速度快，精度高；比超滤剪应力小，活性收率高；分离机理简单，操作参数少，规模放大容易。缺点选择性低，处理量小；洗脱展开后产品被稀释。,第三节 吸附与离子交换,1、吸附吸附：溶质从液相或气相转移到固相的现象。活性炭：脱色，除臭等。活性炭称吸附剂。吸附剂：多孔微粒。,活 性 炭（Active carbon）,粉末活性炭,锦纶活性炭,大孔网状吸附剂,特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。但价格昂贵，吸附效果易受流速以及
8、溶质浓度等因素的影响。,大孔网状吸附树脂的种类,非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，交联剂为二乙烯苯，又称芳香族吸附剂。中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而成，交联剂亦为甲基丙烯酸酯，故又称脂肪族吸附剂。极性吸附剂：丙烯酰胺或亚砜经聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。,大孔吸附树脂的吸附机理,非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附各种有机物，其吸附能力与树脂的化学结构、物理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循以下规律：非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质；极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质；中等极性吸附剂兼有以上两种能力,吸附剂对溶质的吸附作用按吸附作用力区分主要有三类：物理
9、吸附：吸附剂、吸附质之间范德华力。化学吸附：吸附剂、吸附质之间化学键力。离子交换吸附（简称离子交换）：吸附剂为离子交换剂，离子交换剂表面含有离子基团或可离子化的基团，通过静电引力吸附带相反电荷的离子，吸附过程中发生电荷的转移。离子交换的吸附可通过调节pH或提高离子强度的方法洗脱。,常见的吸附类型及其主要特点,有机高分子吸附剂：多孔性聚乙烯、多孔性聚酯等树脂具有大网络细孔结构，用于抗生素，维生素B12分离浓缩。还有多孔性纤维素，琼脂糖凝胶，葡聚 糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，羟基磷灰石(层析、电泳)。,离子交换树脂的结构,具有三维空间立体结构的网络骨架联接在骨架上的活性基团活性基团所带的相反电荷的活性
10、离子（可交换离子）,树脂的网络骨架,离交树脂三维空间立体结构,2、离子交换剂分为阳离子交换剂 和 阴离子交换剂阳离子有交换能力 阴离子有交换能力活性基团为酸性 活性基团为碱性,离子交换的分类,按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳 强阴、弱阴,离子交换的一般过程,根据有离子交换能力的pH范围不同分为：强酸性、弱酸性阳离子交换剂强碱性、弱碱性阴离子交换剂,常用的离子交换树脂,强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；
11、弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；,强离子交换剂的离子化率基本不受 pH值影响，离子交换作用的pH范围宽，弱离子交换剂的离子化率受pH值影响很大，离子交换作用的pH范围小。弱酸性阳离子交换剂在pH值减低时，离子化率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱，弱碱性离子交换剂在pH升高时，离子化率逐渐降低，离子交换能力逐渐丧失。离子化率与离子交换能力成正比。,P184表6、2列出了生物分离中常用的离子交换基团常用于蛋白质交换
12、的离子交换基团阴离子交换基：二乙胺乙基（DEAE)季铵乙基（QAE)。阳离子交换基：羧甲基（CM),膦酸基(P),磺丙基（SP)。所用的基质材料主要有纤维素，葡聚糖凝胶和琼脂凝胶。,DEAE anion exchanger,CMC Cation Exchanger,离子交换操作方法,树脂预处理离子交换吸附洗脱,交换容量：单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。是表征离子交换能力的主要参数。阳离子交换剂：R-H+NaOH=R-Na+H2O阴离子交换剂：2R+Cl-+Na2SO4=R2+SO42-+2NaCl,蛋白质等生物大分子与小分子化合物离子交换特性有很大
13、差别：A、蛋白质分子量大，树脂孔道对其空间排阻作用大，不能与所有的离子交换活性中心接触。B、离子交换吸附蛋白质分子会妨碍其他蛋白质与未吸附蛋白质离子交换基团发生作用。,C、蛋白质是多价电荷，离子交换中可与多个离子交换基发生作用。因此蛋白质的交换容量远低于无机离子的交换容量。,第四节 离子交换层析,一、原理与操作,原理利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。荷电溶质在离子交换剂上的分配系数为：,其中：I为流动相的离子强度；A和B为常数；m为离子强度无限大时溶质的分配系数。,对于不同的溶质，A与B不同，即在离子交换剂上的分配行为不同，在洗脱
14、过程中彼此得到分离。,蛋白质是多价的两性高分子电解质，具有等点pI，当溶液pH偏离等电点，pH大于pI时，带负电荷，可被阴离子吸附剂所吸附，pH小于pI时，带正电荷，可被阳离子交换剂吸附。B值为蛋白质的净电荷数与反离子价数（离子交换基的离子价数）之比。由于蛋白质净电荷数常为两位数以上，B值很大。因此离子强度的微小改变会引起分配系数很大改变。,由于离子交换过程中溶质的分配系数随离子强度增大而急剧降低，故离子交换操作需在低离子强度下进行。,IEC操作（离子交换层析操作）很少采用恒定洗脱。因为：蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，即离子强度的微小改变，引起分配系数的很大变化；不同蛋白质的B值可能相差
15、很大，即在同一离子强度下不同蛋白质分配系数可能相差非常大。,若采用离子强度不变的流动相进行恒定洗脱，不同蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱，造成洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅度增加。,多采用梯度洗脱法线性梯度洗脱法流动相离子强度线性增大，溶质的分配系数m连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于洗脱的溶质在较小的流动相体积下洗脱。通过改变流动相离子强度的增大速度，可调整溶质的洗脱体积，在改善分离度的同时缩短洗脱时间。,特点优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。,逐次洗脱法流动相离子强度阶跃增大，溶质的分配系数的
16、降低和移动速度的增大也是阶段式的。是介于恒定洗脱和线性梯度洗脱之间的一种洗脱法。特点优点：不需特殊的调配浓度梯度设备，操作简便；缺点：容易出现干扰峰；此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。洗脱操作参数的设计较困难。,梯度洗脱的浓缩作用IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。,蛋白质离子交换分离的基本步骤,平衡上样吸附洗脱再生,Equilibration,Sampleapplicationand wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,二、应用及
17、特点,应用由于IEC基于离子交换的原理分离纯化生物产物，通用性和选择性均远高于GFC，所以是蛋白质、多肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。思考题：为什么离子交换层析操作中很少采用恒定洗脱法？,IEC特点优点处理量大，具浓缩作用，可在较高流速下操作；应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短；产品回收率高；商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也较低。,缺点操作参数多，影响分离特性的因素非常复杂，过程设计和规模放大困难。,例题,用SephadexG-100柱（排阻层析柱）及强酸性阳离子交换柱（离子交换柱）来分离核糖核酸酶（分子量 14000，pI 7.8）胃蛋白酶（分子量
18、 36000，pI 1.5）及胰岛素（分子量 5700，pI 5.3）指出以上物质通过两个柱洗脱顺序，并简要说明分离原理。,答：SephadexG-100 pH-pI 大，带电荷多。阳离子交换柱。pH 吸附性强，m大 洗脱顺序：,答：SephadexG-100 凝胶过滤中，分子量大的物质先被洗脱下来，凝胶过滤中的洗脱顺序为：胃蛋白酶、核糖核酸酶、胰岛素。（5分）离子交换拄中，pH与pI差值大的物质带电荷多。带电荷多的吸附性强。阳离子交换柱中，pHpI带正电荷，带正电荷多少的顺序为：核糖核酸酶、胰岛素、胃蛋白酶。所以洗脱顺序为：胃蛋白酶、胰岛素、核糖核酸酶。（5分）,例题,简述离子交换层析的分离
19、原理。为什么离子交换层析常用梯度洗脱法？该法有何优点。用增加盐离子强度的方法，从指定的离子交换柱上洗脱下列蛋白质，指出它们被洗脱下来的先后顺序，并说明理由。已知细胞色素C的pI=10.6，溶菌酶pI=11.0，卵清蛋白pI=4.6，肌红蛋白pI=7.0，胃蛋白酶pI=1.0，脲酶pI=5.0，血红蛋白pI=6.8。（1）细胞色素C，溶菌酶，卵清蛋白，肌红蛋白（阴离子交换柱）；（2）细胞色素C，胃蛋白酶，脲酶，血红蛋白（阳离子交换柱）。（15分）,第五节 疏水性相互作用层析,一、原理与操作,原理：HIC利用表面偶联弱疏水性基因的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用
20、的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。,疏水作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography）,Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity,操作：与IEC不同，蛋白质的吸附在
21、高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。原因：根据蛋白质盐析沉淀原理，在离子强度较高的盐溶液中，疏水性相互作用增大。所以，蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐浓度（离子强度）的提高而增大。,二、疏水性吸附剂,各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有：苯基、短链烷基（C3C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。因疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，一般为1040mol/cm3，过小则疏水性吸附作用不足，过大则洗脱困难。,强烈的洗脱条件，会使被洗脱的蛋白质变
22、性。可根据系列柱实验来判断蛋白质表面的疏水性质。从而决定分辨和纯化蛋白质的方案。,Mechanism of HIC,疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用氨基的结合或醚键结合。,其中：R(CH2)nCH3，n=27；或R R表示疏水性配基。,三、应用及特点,应用HIC基于疏水性吸附分离纯化蛋白质类生物大分子，与IEC的离子交换作用完全不同，可与IEC互补短长，分离纯化利用IEC难于分离的蛋白质。,特点优点由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液；通过改变疏水配基链长和密度可调节吸附力，因此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂；疏水性吸附剂种类多，选
23、择余地大，价格与离子交换剂相当。,缺点由于疏水性相互作用机理比较复杂，吸附剂的选择和洗脱分离条件不易掌握。较高盐浓度下，疏水作用色层分离法难以得到很好的分辨率。水中溶解度较差蛋白如球蛋白、膜结合蛋白低盐浓度也能很强地吸附，用疏水作用层析也难将它们分离。,思考题：简述疏水性相互作用层析用于蛋白质分离的原理和操作。,填空题,1、DEAE-纤维素是一种交换剂，CM-纤维素是一种交换剂。2、一个带负电荷的蛋白质可牢固地结合到阴离子交换剂上，因此需要一种比原来缓冲液pH值和离子强度的缓冲液，才能将此蛋白质洗脱下来。,选择题,1、进行疏水吸附层析时，以下哪种条件比较合理（）（A）在有机溶剂存在时上柱，低盐
24、溶液洗脱（B）在有机溶剂存在时上柱，高盐溶液洗脱（C）低盐条件下上柱，高盐溶液洗脱（D）高盐溶液上柱，按低盐、水和有机溶剂顺序洗脱（E）低盐条件上柱，低盐洗脱,回答题,用增加盐离子强度的方法，从指定的离子交换柱上洗脱下列蛋白质，指出它们被洗脱下来的先后顺序，并说明理由。已知细胞色素C的 pI=10.6，溶菌酶pI=11.0，卵清蛋白pI=4.6，肌红蛋白pI=7.0，胃蛋白酶pI=1.0，脲酶pI=5.0，血红蛋白pI=6.8。（1）细胞色素C，溶菌酶，卵清蛋白，肌红蛋白（阴离子交换柱）；（2）细胞色素C，胃蛋白酶，脲酶，血红蛋白（阳离子交换柱）,在一种抽提液中含有三种蛋白质，其性质如下：蛋白质 相对分子量 等电点 A 20000 8.5 B 21000 5.9 C 5000 6.0 试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。,同学们辛苦了！,本章内容到此结束,
