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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制
2、的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。也就是用选择性培养基筛选。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,从用途看此培养基属于哪类？,从化学成分看此培养基属于哪类？,选择培养基,合成培养基,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,此培养基是否对微生物具有筛选作用？如果有
3、，是如何进行筛选的？,有，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,判断该培养基有选择性,只生长分解尿素细菌,生长多种微生物,是,1.稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。计算方法：,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌
4、落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,.统计菌落数目：,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为结果。你认为哪位同学的结果更接近真实值?你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,分析：,答：都不接近，都需要改进。第一位同学需要设置重复实验组。第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需要重新实验
5、。,小结为使结果接近真实值可将同一稀释度的稀释液涂布到三个或三个以上的平板中培养。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数，计算出菌落平均数统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,2、显微镜直接计数法：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，A同学从对应的106 倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌
6、 落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),如何设计实验证明呢？,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二.实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的
7、信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,三样品的稀释,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,保证获得菌落数在30300之间适于计数的平板,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,分析：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
8、1：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528
9、的温度下培养34d。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,微生物的培养与观察,三.结果分析与评价 P251.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.稀释操作是否成功：如果得到了2个或2个以上的菌落数在30300的平板，则说明稀释操作成功。同一稀释倍数的三个重复组的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确，要重新实验。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五.
10、课外延伸,2、鉴定大肠杆菌的方法：在培养基中添加 培养该细菌，如果出现菌落呈现，则说明有大肠杆菌。,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变，说明该细菌能够分解尿素。,酚红,红,1、鉴定分解尿素的细菌的方法,伊红-美蓝,黑色且有金属光泽,本课题知识小结:,1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,C,D,3.下列说法不正确的是（）A
11、.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,5、下列叙述错误的是 A因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离B测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解
12、尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同C只有得到了3个或3个以上菌落数目在30300的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数D牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落,C,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;,天然培养基：,
