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1、血清蛋白质组学技术筛选NSCLC放化疗敏感性标志物,山东省肿瘤医院放疗科黄伟 丁秀平 李宝生,第一部分,放化疗敏感性血清标志蛋白的筛选,蛋白质组学与预测标记物,放化疗敏感性的变化不是某一个蛋白发生变化所致，而是组织或细胞内大量蛋白质所形成的复杂网络变化所致，是各因素相互作用引起的。蛋白质组学(proteomics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律，实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析。,1.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱2.电喷雾电离串联质谱3.表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱,其原理是先进行等电聚焦，蛋白质沿PH梯度分离，到达各自的等电点，随后按分子量把
2、复杂的蛋白质成分分离,巨量生物信息资源的收集、存储、处理、共享、研究和开发。由数据库、计算机网络和应用软件3大部分组成,蛋白组学技术流程,双向凝胶电泳(2-DE),质谱技术(MS),生物信息技术,质谱技术,基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）：利用基质吸收激光的能量使固相的多肽样品离子化，获得蛋白质的肤质量指纹图（PMF），然后通过相应的数据库搜索，鉴定蛋白质；电喷雾质谱（ESI-MS）：在喷射过程中以连续离子化方式使多样品电离；表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）:蛋白芯片技术。串联质谱（MS/MS）：用于肤段的氨基酸测序；液相色谱-质
3、谱联用（LC MS/MS）,LC-MS/MS联用的优点,因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析 LC-MS/MS没有偏向性，自动化程度高、可重复性好，为发现新的与疾病相关的血清蛋白标记物奠定了基础。,患者资料,16例患者放疗期间给予同步含顺铂双药方案化疗2周期 16例肺癌（腺癌或鳞癌）病人放化疗前的血清RECIST 评价疗效，分为治疗敏感组和抗拒组，各8例患者，根据病理类型、年龄、性别、化疗方案进行一一配对,*放疗：40Gy后复位行后程加速超分割，1.4Gy，bid，至总
4、量*化疗：含铂类两药联合同步化疗2周期,患者详细临床资料,蛋白处理,血清收集,去除高丰度蛋白（Aurum Serum Protein Kit）,蛋白提取,蛋白定量（Bradford 法）,2-DE,用IPGphor IEF System进行一相等电聚焦,将聚焦后的胶条在SDS平衡液中平衡两次,取出胶条在PROTEN II xi Cell上进行垂直SDS-PAGE第二相分离,分别取两个实验组混合血清各350l进行电泳，每组实验重复3次。,银染色方法,凝胶图象分析,用Umax PowerLook 1100透射扫描仪扫描凝胶，Imagemaster图像分析软件包对扫描图谱依次进行点检测、背景消减，建
5、立平均凝胶，匹配、量化获取斑点的相关信息等分析用两组血清蛋白质点数最多的敏感组胶图为参考胶，对六幅胶图进行虚拟重建，再利Imagemaster软件将两张胶图中的斑点进行匹配，匹配不上的斑点视为差异点，选取表达量差异2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点,质谱鉴定,考染 胶内酶解法酶解蛋白 nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱为分析柱 Synapt High Definition Mass Spectrometry质谱仪（Waters公司）进行质谱分析SWISS-PROT蛋白质数据库,液相色谱-质谱（LC-MS）仪,nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱系统
6、配备自动进样器,Synapt High Definition Mass Spectrometry 质谱仪,结果1.高丰度蛋白的去除效果,图1.未去除高丰度蛋白的血清2-DE图谱,图2.去除高丰度蛋白后的血清2-DE图谱,结果2.2-DE图谱及图象分析,结果3.差异蛋白质斑点的鉴定,差异点为78个，根据3次2-DE结果，软件自动结合人工方式选取共同的蛋白质差异点8个进行质谱分析，其中在抗拒组上调的7个，抗拒组下调的1个,结果4.血清蛋白质鉴定结果,结果5.鉴定蛋白质的功能分类,细胞凋亡,POTEE,TXLNG,APOA1、A1AT,TMC5B、GFAP,转录和翻译,细胞结构蛋白,代谢,ApoA-
7、I,载脂蛋白A1（ApoA-I）是高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)的主要结构蛋白，是一种急性时相反应蛋白 2004年Zhang等报道前列腺癌患者血清载脂蛋白A-I浓度较正常对照者显著降低程志强还报道骨转移的前列腺癌患者血清中ApoA-I的表达率显著低于无骨转移的患者2008年刘桂芝等报道ApoA-I在人期肺癌组织及正常癌旁组织中具有差异表达。,1-AT,血清1-抗胰蛋白酶（1-AT）,肝内和肝外合成，急性相蛋白，1-AT浓度在炎症，感染，肿瘤，肝病时均显著增加研究发现多种恶性肿瘤细胞可以合成1-AT，并且组织局部的1-AT具有明显抑制肿瘤细胞生长、转移和
8、实体瘤血管形成的特点。近年来，1-AT开始作为肿瘤的标记物协助诊断肿瘤和监测预后，但缺乏特异性。黄立军，1-AT可能与非小细胞肺癌分化程度呈正相关，与肿瘤大小及临床分期呈负相关，即恶性程度愈高、临床分期愈差，1-AT表达水平越低。因此，检测1-AT表达可能是用于判断肺癌恶性程度的有价值指标之一。研究证实肺癌及非癌性疾病组血清1-AT水平均显著高于正常对照组，肺癌且明显高于非癌性肺病组。,蛋 白 验 证,第二部分,研究方法,入组标准：初治、III期、NSCLC 共50例患者实验方法：酶联免疫吸附试验（ELISA）统计方法：*单因素方差分析（one-way ANOVA）*独立样本t检验*受试者工作
9、特征（ROC）曲线,入组患者资料,疗效评价：敏感组37例-CR 10例，PR 27例抗拒组13例-SD 9例，PD 4例,研究结果,一.不同亚组ApoA-1和1-AT比较（one-way ANOVA）,注：各亚组之间样本均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），粗体数值表示具有统计学意义,研究结果,二.放疗前、中、后ApoA-1和1-AT组间比较,研究结果,三.ApoA-1在全组、敏感组、抗拒组 于放疗前、中、后平均浓度柱状图,研究结果,三.1-AT在全组、敏感组、抗拒组 于放疗前、中、后平均浓度柱状图,研究结果,四.放疗前1-AT对放化疗抗拒者预测能力,研究结果,四、Post/Pre1-AT对放化疗敏感者预测能力,研究结论,1-AT与NSCLC的肿瘤分期及病理类型有关治疗前1-AT敏感组水平明显低于抗拒组，治疗前患者1-AT基础水平能预测NSCLC放化疗敏感性ApoA-1在预测NSCLC放化疗敏感性 方面作用较局限研究结果将刊登在“neoplasms”,致 谢,军事医学科学院蛋白质组中心（国家生物分析中心）王鸿丽、赵永强、李卫华老师对我科研工作的指导和帮助！山东省医学科学院基础所崔亚洲老师在蛋白结果分析上对我的指导和帮助！,Thank You!,
