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1、第三章 动物细胞工程制药,生产用动物细胞的要求和获得,生产用动物细胞的要求,早期规定：只有从正常组织分离的原代细胞才能用于生产生物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞等。第二阶段：二倍体细胞，如WI-38,2BS等。当前：按照美国FDA规定，各国参照执行。异倍体细胞,生产用动物细胞的获得,原代细胞：直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化而获得的细胞悬液。二倍体细胞：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。转化细胞系：这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得无限增殖能力。融合细胞系：由两个或两
2、个以上的合并成一个细胞的过程。重组工程细胞系：采用基因工程手段构建的各种工程细胞。如BHK-21,C127,CHO-K1,COS,MDCK,Namalwa等。,二倍体细胞特点,染色体组型仍是2n的核型；具有明显的贴壁依赖和接触抑制特性；只有有限的增殖能力，可连续传代培养50代；无致瘤性。,细胞融合方法,仙台病毒融合法聚乙二醇融合法电融合法,3.1.2 基因工程细胞的构建和筛选,真核细胞基因表达载体的构建：通常利用杆状病毒载体和穿梭质粒载体。基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选：,常用生产用细胞特性,细胞库建立,原始细胞库（MCB）：应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水
3、平尽可能低的细胞。生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）,3.2 动物细胞培养的基本方法,细胞分离：离心分离和消化分离细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代细胞冻纯：采用液氮低温冻存法细胞复苏：要求快融。,3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式,培养方法：悬浮培养、贴壁培养、贴壁-悬浮培养。操作方式：分批操作式、半连续式操作、灌流式操作,3.4 动物细胞生物反应器,3.4.1 动物细胞反应器基本要求,制造生物反应器材料对细胞必须无毒生物反应器应具有良好的传质、传热和混合性能密闭性能良好，可避免外来
4、微生物污染能对环境理化参数自动检测和调节控制，控制精度高，能保持环境质量均一可长期连续运转容器内面光滑、无死角拆装、连接和清洁方便，能耐高温消毒设备成本尽可能低,3.4.2 动物细胞反应器主要类型,搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋式生物反应器固定床或流化床式生物反应器,3.4.3 培养过程需检测的物化参数,在线检测：温度、pH、搅拌速度、溶氧等离线检测：氨基酸浓度、葡萄糖、乳酸和氨离子浓度等经计算得到的参数：细胞群体倍增时间、细胞比生长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等。,3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求,3.5.1 动物细胞产品纯化,工程细胞表
5、达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大；由于产品要用于人，对产品纯度要求高；产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性；细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。,3.5.2 常用纯化方法,离心离子交换层析凝胶过滤亲和层析盐析和有机溶剂沉淀透析高效液相层析,3.5.3 动物细胞产品质量要求工程细胞,有该细胞系的历史资料有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定无细菌、真菌、支原体和各种病毒,3.5.4 动物细胞产品质量要求纯化工艺,生产厂房条件必须符合国家GMP规定细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水操作环境、柱体、洗脱液等的温
6、度尽可能保持4度左右所有器材、载体都需经无菌、无热源处理应记录产品纯度、提纯倍数和回收率,动物细胞产品质量要求产品（1）,纯度：98以上，通过HPLC和非还原SDS-PAGE检测生物活性：采用国际通用方法，并用国际或国家标准品校正产品比活性产品蛋白质特性的要求：相对分子量、等电点、紫外吸收光谱、氨基酸序列测定、氨基酸组成、肽图、免疫印记实验，圆二色谱分析,动物细胞产品质量要求产品（2）,杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。稳定性临床前安全性和有效性评价临床实验的安全性和有效性评价,3.6 动物细胞制药前景与展望,3.6.1 改进表达载体，提高表达水平和产量,采用更强的启动子和增强子更好的利用扩增系统或寻找高表达位点采用或改造更好的宿主细胞,3.6.2 利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本,采用代谢工程改造工程细胞改进培养工艺，降低生产成本,3.6.3 抑制细胞周期，延长培养周期,通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；用抗氧化剂等化学添加剂阻断细胞凋亡；采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞。,3.5.4 采用糖基化工程，提高产品质量 3.5.5 转基因动物研究 3.5.6 组织工程的研究,
