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1、第八章 发酵工程下游加工工程(downstream processing)第一节 概 述一.重要性1.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节2.发酵液是复杂的多相系统2.生物产物的特殊特点：浓度、稳定性等,几种产品在发酵液中的浓度 产品 典型浓度（g/L）抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有机酸 100 酶 20 蛋白质 10,4.投资费用高 抗生素、乙醇、柠檬酸占60%纯化蛋白质8090%5.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展,5.上游要为下游创造条件 选育不产生杂质的菌种 胞内产物变为胞外产物 在细胞内形成包含体 给目的产物接上特殊“物质”,二.基本原理 根据混合物中不同组分
2、分配率的差异将其分配于几个物相中，如溶剂提取、盐析、结晶等或将混合物置于某一物相中（液相），使各组分分配于不同区域，如电泳、超离心、超滤等,三.一般程序1.预处理和固液分离：加速固液相分离2.细胞破碎分离胞内产物3.初步纯化（提取）：除去与目的产物性 质差异很大的杂质4.高度纯化（精致）：除去与产物性质相 似的杂质5.产品加工,第二节 发酵液的预处理和固液分离一.预处理分离菌体和其它悬浮颗粒去除部分可溶性杂质改变滤液的性质,（一）过滤特性的改变 产物浓度低110%悬浮颗粒小 液相粘度大 性质不稳定,1.降低液体粘度 稀释 升高温度2.调节 pH 改变某些物质电荷特性3.凝聚与絮凝 改变细胞、细
3、胞碎片及溶解大分子物质 的分散状态,4.加入助滤剂 不可压缩的多孔颗粒 硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠粉、白土、炭粒、淀粉等5.加入反应剂 消除杂质对过滤的影响 新霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠 磷酸钙：助滤剂，使某些蛋白质凝固,（二）去除高价无机离子1.Ca2+、Mg2+、Fe2+等影响树脂的交换容量2.用草酸去除钙离子，草酸钙还能促进蛋 白质凝固3.三聚磷酸钠与镁形成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+4.黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+,（三）去除可溶性杂蛋白1.蛋白质等电点沉淀 两性物质
4、，稳定性与所带电荷有关 酸性溶液中带正电荷，碱性中带负电荷2.酸性溶液中与阴离子物质结合形成沉淀 三氯醋酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味 酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等3.碱性溶液中与阳离子形成沉淀 Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等,4.盐析 亲水胶体，加入碱金属中性盐，脱水剂5.热变性 一般蛋白质在7080C发生不可逆变性 如链霉素发酵液在pH3.0，加热到70 C保 持0.5h后过滤 柠檬酸发酵液在80 C处理6.加入絮凝剂7.吸附作用,（三）去除色素及其它物质1.色素产生 微生物生长代谢产生，培养基带来2.去除方法离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等吸附如DEAE-纤维素从含酶溶剂中
5、吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋白质,二.发酵液固液分离（一）离心（二）过滤 菌种对过滤速度影响很大 真菌容易过滤，放线菌则难 培养基组成对过滤也有影响,第三节 微生物细胞破碎一.微生物细胞壁的组成与结构 微生物种类，培养基组成影响细胞壁二.常用细胞破碎方法1.珠磨法（bead mill）实验室：Mickle捣碎机、匀浆器Braun 中试：胶质膜处理 工业：高速珠磨机（High-speed bead mill）,2.高压匀浆法（High pressure homogenization）大规模细胞破碎方法 高压匀浆器 对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多 次循环方法 丝状真菌、较小的G+菌，含
6、有包含体（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此 法,3.超声波破碎（Ultrasonication）杆菌比球菌容易破碎 G-比 G+容易破碎 酵母菌不易破碎 实验室较常用的方法，样品温度？4.酶溶法（Enzymatic lysis）lysozyme protease cellulase zymolyase 价格高，通用性差，产物抑制的存在 自溶法（Autolysis）,5.化学渗透法（chemical permeation）改变细胞壁或细胞膜的通透性 TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂 双层 EDTA：对G-菌外膜有破坏作用 有机溶剂：分解细胞壁中的脂类 变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用 优点：选择性，易于固液分离 缺点：通用性差，效率低，毒性,6.其他方法 X-press法 渗透压法（osmotic pressure）反复冻溶法多种方法结合与上游过程结合与下游过程结合,
