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1、1,Xin ZhangSchool of Marine Science Department of Food Science&TechnologyNingbo University,发酵工程实验,张 鑫宁波大学 海洋学院 食品科学与工程系625186,2,乳酸菌的功能与应用价值,抗菌，防腐，抗氧化，微生态（益生菌等）,发酵保健食品（酸奶）；发酵代谢产物：有机酸，胞外多糖，抗菌肽，等；果蔬发酵（酸菜等）；环境废物转化，环境保护；等。,乳酸菌的应用,乳酸菌的功能,3,发酵工程的研究内容构成,工业微生物（生产菌株）的分离与筛选；菌株改造（菌种选育）培养基制备技术；发酵过程控制与优化；产物的分离与纯化
2、,4,第一部分：乳酸菌的分离、筛选与保藏第二部分：乳酸菌的培养与发酵测定附上：实验原始记录 实验一：实验准备 实验二：乳酸菌的分离与筛选 实验三：菌种培养与保藏 实验四：乳酸菌的发酵培养 实验五：乳酸菌发酵测定与产物分析,一、实验目的与意义及原理等二、材料与方法（或步骤）三、结果与分析问题回答,实验报告撰写基本格式,撰写完成实验报告（上交材料）,实验内容设计,5,实验二时间安排,周XX,培养基制备；分离：划线分离；稀释分离,选菌落，接入斜面培养基（标记），培养；保存,6,实验乳酸菌菌株,斜面移接活化,细胞生长测定,产酸变化,注意点：新保存的菌株可直接接种，不必再活化。,菌种移接至发酵三角瓶，培
3、养(E2),（细胞生物量g/L：离心测菌体重量；混浊度描述）,（测定pH变化：酸度计）,发酵产物乳酸定性分析(E3),（薄层层析法）,总实验流程,采样,分离(E1),乳酸菌菌株,7,实验一：培养基制备与器材准备,每组内容,每人倒1个平板用于划线分离做一套稀释倒平板，1个稀释度倒平板1个斜面培养基每人1支，,第一部分,MRS培养基200ML，营养琼脂30ML，无菌水试管4支（9ML），无菌移液管5支（1ML），,注意：碳酸钙按比例混合（MRS培养基200ML加5克）；培养基可几个组合并配制。发酵模块：共6个组，每3个组配600ML，营养琼脂一个班配1瓶。,8,分离得到的乳酸菌菌株（编号）,菌落观
4、察,生理生化特性（略）,形态鉴定（略）,采样,稀释,倒平板,编号，斜面培养与保存,（通过产酸特性直接鉴定）,实验二：乳酸菌的分离与培养,第一部分,9,实验三 乳酸菌菌种的培养与保藏,分离得到的乳酸菌菌株（编号）,斜面移接与培养(每一株）,1株保藏,1株待以下实验用,注意点：注明菌种编号与日期；如Lcd131,Lcd132；（例：陈丹，第一组第3位同学）,第一阶段结束，总结,安排一周完成,10,时间安排（制药班级，21人）,周三,培养基制备；分离：划线分离；稀释分离,周五,选菌落，接入斜面培养基（标记），培养；配制发酵培养基；（每个菌株接种2瓶平行实验）,下周一,下周三,接种发酵培养基（标记），
5、每个菌株接种2瓶。开始记录时间。（16至24h内检测一次）,发酵结束，样品检测，乳酸薄层层析法测定。,（周二）,（周四）,（周四）,11,实验乳酸菌菌株,斜面移接活化,细胞生长测定（自选）,产酸变化,注意点：新保存的菌株可直接接种，不必再活化。,实验四 乳酸菌培养与发酵测定,菌种移接至发酵三角瓶，培养,（细胞生物量g/L：离心测菌体重量；混浊度描述）,（测定pH变化：酸度计）,发酵产物乳酸定性分析（E3）,（薄层层析法）,总实验流程,第二部分,12,发酵培养基的配制,接种3环,培养瓶包扎方法,说明,13,细胞生长的测定,细胞湿密度：单位体积(ml)发酵液菌体的重量g（湿重）;方法：取一定量(m
6、l)发酵液，经离心去除上清液，菌体称重。细胞浓度：单位体积(ml)活细胞数(cfu)，单位:cfu/ml 方法：取一定量(ml)发酵液，经适当稀释后。倒平板培养计数，再由菌落数与稀释倍数的积。光密度（OD）：反映细胞的混浊度；方法：由分光光度计在一定波长下测定吸光值。,14,分析结束以后每一组清洗各自的实验物品，包括斜面菌种等。,请同学注意：,发酵液预处理可直接取发酵清液，调pH至3左右,因培养结束；最后一次分析检测不用无菌操作！,15,实验五 乳酸菌发酵产物（乳酸）的定性分析-薄层层析法,方法流程,1.发酵液预处理可直接取发酵上清液，调pH至3，另用自然pH做对照；2.划线及点样时，不可将薄
7、层刺破，点样斑点直径不超过2mm，重复点样时要在同一位置。每次点样后适当吹干。3.显色时，注意喷雾均匀。4.实验数据处理：记录显色点与点样点间的距离。,发酵液预处理,展开系统饱和,点样,展开,显色,操作注意事项,记录计算，等,16,展层溶剂：正丁醇：甲酸：水=80：15：5（V/V/V）；,展开系统的饱和：预先取适量配制好的展开剂注入层析缸一边，将已点样的的薄板也放入层析缸的另一边，密闭层析缸1520min，使展开液蒸汽饱和层析系统,展开：将薄板移至有适量展开液的层析缸一边展开；,显色：3%的溴甲酚绿酒精溶液喷雾，再用热风吹干，注意：显色液喷雾要足够。显色时间要充分。,1、描述分离效果（作图或照片显示）；2、计算Rf值；3、分析实验结果及误差原因。,（请记录以下3个问题）,四、实验结果与讨论,具体操作步骤按照实验指导书,实验报告内容格式参照下页；报告统一提交时间：13周-周四,17,1菌种分离初筛结果,表1 样品A乳酸菌分离初筛菌落描述,结果与分析,材料与方法（或步骤）,1.样品：分离样品采自。,
