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1、免疫学研究方法,免疫荧光技术酶联免疫吸附试验蛋白质印迹流式细胞术,免疫学研究的主要方法,一、免疫荧光,免疫荧光概述免疫荧光基本原理免疫荧光基本操作免疫荧光技术的相关应用口腔应用实例,1.概述 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。,2.基本原理,直接免疫荧光法：直接法是将荧光素标记在抗体上，直接测定相应抗原。标记有荧光素的抗体与相应的抗原反应，
2、在紫外光的照射下，用显微镜观察荧光现象。优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点：只能检测一种抗原，灵敏度不高。,间接免疫荧光法：间接法与间接ELISA相似，引入标记二抗，可以检测抗原，也可以检测抗体。优点：一抗可以结合多个标记二抗，固灵敏度比直接法高。缺点：比直接法易出现非特异荧光。,免疫荧光原理示意图,3.免疫荧光实验过程,细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%）细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）细胞膜穿透（Triton X-100 等）封闭（3%BSA-PBS等）一抗孵育 荧光二抗孵育 胞浆/核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI）封片荧光显微镜拍照,荧光抗体孵育,4
3、.免疫荧光技术的相关应用,抗核抗体(均质型),抗核抗体(斑点型),抗核抗体(核膜型),自身抗体检测,第八节 口腔免疫学研究的主要方法,病原体检测,细菌（藤黄微球菌）,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,第八节 口腔免疫学研究的主要方法,免疫病理检测,肿瘤（人肝癌细胞）,第八节 口腔免疫学研究的主要方法,5.口腔应用举例,天疱疮患者病损部位自身抗体的检测1.取天疱疮患者静脉血2ml，离心分离血清，-20保存。2.取正常皮肤做冰冻切片，加入FITC标记的抗人Ig-G、IgA、IgM、C3作间接免疫荧光染色，出现亮绿色荧光为阳性，以显示荧光的血清最大稀释度作为抗体的滴度。,直接免疫荧光IgG 上皮棘层呈翠
4、绿色渔网状荧光,细胞免疫荧光技术组织免疫荧光技术,直接法间接法,小结,二、酶联免疫吸附试验,ELISA的原理和基本特点ELISA的类型ELISA基本操作步骤数据处理结果判断 口腔应用举例,1.ELISA的原理,ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA），其免疫学原理:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。其特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,2.基本类型,抗体测定法 间接法检测
5、特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法,间接法检测特异性抗体,优点:只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法操作简单迅捷缺点：可重复性差通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断,双抗体夹心法检测可溶性抗原,双抗夹心法,改良双抗夹心法,优点：待测抗原需要2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建
6、立此法；重复性较好；缺点：操作复杂，费时费力,3.ELISA 基本操作步骤,样品的保存试剂的准备固相载体包被加样孵育(温育）洗涤显色和比色注：每种ELISA试剂盒均有具体步骤说明,4.ELISA 数据处理,根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度,5.结果判断,定性实验:显色反应后，如液体颜色变成蓝色则为阳性；仍为无色液体，则待测样品为阴性。,定量实验1.标准品和待测样品的OD值减去空白孔的OD值2.绘制标准曲线，计算出待测样品浓度 根据绘制的标准曲线以及待测样品的OD值可计算出待测样品浓度。,6.口腔应用实例,龈沟液中细胞因子的
7、检测龈沟液采集：去除待检牙牙面牙石，隔湿，吹干牙龈并擦干牙面，用2 mm10mm Whatman 3M滤纸条两条，插入取样部位的牙周袋内，30s后取出(若血液和唾液污染，则弃置不用)，3min后在同一位点再次取样，将两条滤纸条作为一个标本置于同一Eppendorf（EP）管中，用龈沟液测量仪测量龈沟液量，在EP管中加入200l PBS-T，置于-70的冰箱内保存。,ELISA方法检测龈沟液中细胞因子（如IL-8/IL-4/TNF-等）的浓度：将标本于冰箱内取出，室温解冻，4离心后取上清备用。利用检测试剂盒，ELISA检测龈沟液中细胞因子的浓度。,用途：血清、血浆、细胞上清液、组织匀浆及相关液体
8、样本中免疫炎性因子、抗原和抗体的检测。,小结,三、Western Blot,简介原理操作流程应用口腔应用举例,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,1.简介,2.Weste
9、rn Blot基本原理,蛋白质混合样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白）。将PAGE胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)，此过程称为印迹，以利于随后检测反应的进行。然后，将NC膜与抗体一起孵育，使抗体（一抗）与待检测的抗原决定簇结合（电泳分离的特异性蛋白条带），再与荧光素、酶或核素标记的二抗反应，即可检测出样品中的待测抗原并能对其定量。,Western blot原理,第八节 口腔免疫学研究的主要方法,3.Western Blot操作
10、流程,常用仪器,4.相关应用,基础研究：目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的相互作用目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析,临床：在艾滋病病毒感染中，根据出现显色线条的位置可以判断有无针对病毒的特异性抗体，以此法作为确诊试验。使用印迹抗原来测定各种病人的抗体谱已经直接作为临床免疫检验的手段，被称之为确认试验的“金标准”。,5.口腔应用实例,基质金属蛋白酶-28（MMP-28）在口腔扁平苔藓中的表达。取口腔扁平苔藓患者口腔黏膜，所取新鲜标本立即置于液氮中保存。将组织迅速加入预冷的裂解液中，充分剪碎后，超声波细胞粉碎机进一步震碎细胞，置于冰上裂解 30 min，4离心取上清，置于-20保存。
11、采用改良 Lowry法测定蛋白浓度。,取蛋白分别经10%SDS、5%PAGE凝胶电泳后，抗原转至NC膜。放入 5%脱脂奶粉中封闭，PBS洗膜。加入一抗（鼠抗人MMP-28多克隆抗体）4过夜，洗涤后加入二抗（兔抗鼠I gG）37下孵育1h，DAB显色，PBST漂洗，密度扫描并拍照。对 MMP-28表达与 OLP临床参数进行相关性分析。,为什么要作蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。,小结,四、流式细胞术,流式细胞术概述流式细胞仪主要构造和基本工作原理流式细胞仪分析数据常见图形流
12、式细胞术常规检测时的样本制备流式细胞术的应用口腔应用举例,1.流式细胞术概述,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒通过荧光标记进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，目前已在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科的科研和临床广泛应用。流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM)是集合光电子物理，光电测量技术，计算机技术，细胞荧光化学，抗体技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。,第八节 口腔免疫学研究的主要方法,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从
13、分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,流式细胞术的特点,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定性定量,采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。,2.流式细胞仪基本工作原理,流式细胞仪台式机FACSCalibur,双激光 488nm 635nm四荧光参数分选、浓缩系统,大型机FACSVantage SE,科研型八荧光参数高速分选多路分选,3.流式细胞仪主要构造,（1）液流系统（2）光学系
14、统（3）数据处理系统,由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,（1）液流系统,流动室,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）,（2）光学系统,光学系统,侧向
15、角散射（SSC,Side Scatter）,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）,激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比，细胞相对大小及其表面积。,激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性，细胞粒度及细胞内相对复杂性。,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,主要由计算机
16、及其软件组成,（3）数据处理系统,4.流式细胞仪分析数据常见图形直方图（Histogram Plot）,适用于：单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化,二维点阵图（Dot Plot）,适用于双参数分析,人外周全血细胞双参数散点图,5.常规检测时的样品制备,直接免疫荧光标记的样品制备间接免疫荧光标记的样品制备DNA荧光染色的样品制备细胞凋亡检测样品的制备微量全血法免疫荧光标记的样品制备,直接免疫荧光标记的样品制备,取1106个细胞/100l单细胞悬液。一份加入相应量的FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为同型对照样品。室温下避光反应1530min。加入500l
17、 PBS重悬成单细胞悬液上机检测，阳性者表示有相应抗原存在。,间接免疫荧光标记的样品制备,取1106个细胞/100l，加入一抗混匀，置室温下避光反应30min。PBS洗涤细胞，离心沉淀弃掉上清液。用100l PBS重悬细胞，加入FITC或PE标记荧光二抗混匀，室温下反应30min。PBS再洗涤细胞，加入500l PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。,DNA荧光染色的样品制备,将固定过的细胞离心弃上清液，用PBS洗涤。用PBS调整细胞浓度，每份为1106个细胞/100l。加入1000l DNA 荧光染料，室温下避光染色15min后上机检测。,细胞凋亡检测样品的制备,将10的结合缓冲液用蒸馏水稀释成
18、为1，冰育。悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞。离心后弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞（细胞浓度为105106ml）。加入5l Annexin V-FITC和5l PI于细胞悬浮液中，轻轻混匀。将试管置于冰上，避光孵育10分钟后上机检测。,微量全血法免疫荧光标记的样品制备,微量全血直接荧光染色法取肝素或EDTA抗凝全血（100l/份），置1275mm专用塑料试管中。加入20l特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照，室温下避光染色15min。置 Q-PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min，上机检测。,微量全血间接荧光染色法 取肝素或EDTA抗凝全血（10
19、0l/份），置1275mm专用塑料试管中。加入50l特异的单克隆抗体（一抗），室温下孵育30min。置Q-PREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞。离心后弃上清液，PBS洗涤细胞。加入50l荧光（FITC或PE）标记的第二抗体，室温下避光染色30min，上机检测。,6.相关应用,分子生物学细胞生物学免疫学肿瘤学,7.口腔举例,牙髓干细胞的初步鉴定收集无牙体牙髓疾病的恒牙，将拔除后的恒牙立即放人预冷含高倍双抗-MEM培养基中保存，4h内原代取材。体外原代培养的牙髓干细胞放入37、5%CO2培养箱中培养3d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗后换液。,当第二代牙髓干细胞生长融合成单层后，0.25%胰蛋白酶消化，1：3传代。将扩增到一定数量的第二代细胞消化，PBS混悬后计数，调整细胞浓度（11067/ml），离心后弃去上清。PBS混匀后加入FITC-CD34和PE-STRO-1（stromal cell antigen，基质细胞抗原）混匀，冰盒内避光孵育1h后上机分选。,流式细胞仪常检测的细胞特性,小结,思考题：影响免疫荧光技术非特异染色的主要因素及消除方法？如何避免Western blot非特异性条带的出现？,
