口腔细菌的培养及应用.ppt

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1、口腔细胞培养及其应用,武汉大学口腔医学院 郭继华,第一节 细胞培养,一、细胞培养的基本原理,细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能。,培养细胞的形态特点,贴壁型细胞：必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞,按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型,成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状、火焰状、漩涡状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌细胞等等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。,上皮型细胞细

2、胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜状移动，起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,游走细胞型在支持物上呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,悬浮型细胞：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于某些癌细胞和血液淋巴细胞,培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来自血，脾或骨髓 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 生

3、存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态 观察不方便,培养细胞的生长和增殖过程,培养细胞生命期所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。,原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。细胞独立生存性差。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。,传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生

4、命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细

5、胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。,培养细胞一代生存期,所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第n代细胞，即指该细胞系已传代n次。在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：,潜伏期（游离期，贴壁期）对数生长期停止期（平台期）,潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。

6、此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面，有的则来自培养基中的血清。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。,初代培养细胞潜伏期长，约2

7、496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。,特点：是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一是理想的实验用细胞,在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不

8、断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。,细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。,停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形

9、态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。,培养细胞的体外生长环境,无污染环境,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,基 质,玻璃基质塑料饲养细胞生物性基质处理培养表面金属,气体环境和氢离子

10、浓度,Hepers 缓冲液,CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-,CO2:5%,液相环境,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液,天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结 果的分析。易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准

11、化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子 等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。

12、,温度 渗透压,二、细胞培养的基本方法,无菌操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。,培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,培养室的消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min

13、，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。,进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，

14、如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。,基本培养操作技术,培养细胞的取材与分离,取材部位准确严格无菌操作尽快培养减小损伤制备标本,分散组织 机械分离法 消化分离法,培养细胞的纯化,人工纯化（酶消化法，机械刮除法，反复 贴壁法，克隆法等）自然纯化,细胞的冻存与复苏,所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。,低温保护剂的应用,在细胞

15、冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,常规细胞培养法,原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生

16、长的细胞在传代之前称为原代培养。传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。,细胞培养的污染、检测与控制,微生物污染,空气、器材、操作、试剂、组织标本,微生物污染的检测,细菌和真菌的污染和检测 肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法,支原体的污染和检测,造成支原体高污染率的原因：1.支原体大小0.10.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）；2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污

17、染的细胞；7.已受污染的培养基、血清。,支原体之检测：相差显微镜观察法、电镜法Hayflick培养基直接培养法DNA荧光染色法 PCR方法,微生物污染的控制,抗生素除菌法加温处理,化学污染 细胞交叉污染,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,一、牙齿相关细胞,牙髓细胞,培养中的细胞成分：成纤维细胞 未分化的间充质细胞,培养方法,取材,浸泡,修剪,铺瓶,培养,细胞形态特点,免疫组织化学染色,波形丝蛋白表达阳性角蛋白、神经丝蛋白、结蛋白、胶质细胞 原纤维酸性蛋白表达阴性,生长增殖特点,成功率快速增殖期死亡,功能特点,碱性磷酸酶活性矿化现象对钙调节因子的作用对细胞因子的反应对氢氧化钙、羟基磷灰石盖

18、髓剂的反应,牙周膜细胞,培养方法,取材,浸泡,修剪,铺瓶,培养,培养中的细胞成分：成纤维细胞 未分化的间充质细胞,细胞形态特点,免疫组织化学染色,波形丝蛋白表达阳性角蛋白、神经丝蛋白、结蛋白、胶质细胞 原纤维酸性蛋白表达阴性,生长增殖特点,成功率快速增殖期死亡,功能特点,分泌功能矿化功能收缩功能附着能力再生能力,增殖分化影响因素,生长因子胰岛素纤维粘连蛋白抗坏血酸羟基磷灰石,二、唾液腺细胞,细胞形态特点,腺泡上皮细胞导管上皮细胞肌上皮细胞,免疫组织化学染色,腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶

19、抗体染色阳性反应肌上皮细胞：肌动蛋白、S100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应,功能特点,分泌功能,腺泡细胞：淀粉酶、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌导管细胞：胶原肌上皮细胞：胶原,唾液腺细胞的增殖分化,基底潜能干细胞理论单细胞全能干细胞理论双细胞亚全能干细胞理论,增殖分化功能影响因素,细胞因子激素细胞外基质钙离子,三、口腔粘膜细胞,培养方法,组织块法酶消化法,细胞形态特点,免疫组织化学染色,波形丝蛋白表达阴性多种角蛋白表达阳性,功能,分泌：胶原蛋白和非胶原蛋白 金属蛋白酶,四、颌骨相关的硬组织细胞,破骨细胞,形态学特点组织化学染色特点功能,成骨细胞,形态

20、学特点免疫组织化学染色特点功能：,成骨作用对破骨细胞的调节作用,软骨细胞,形态学特点组织化学染色特点功能影响软骨细胞功能分化的因素,五、口腔肿瘤细胞,培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。,形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。,生长增殖 肿瘤细胞

21、在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（25）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。,永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状。,浸润性 浸润性是肿瘤

22、细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。,异质性 所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。,细胞遗传 大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。,培养方法

23、 肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。,口腔鳞癌细胞：舌鳞状细胞癌系涎腺肿瘤细胞：人黏液表皮样癌系 腺样囊性癌系,来源生物学特性,来源生物学特性,来源生物学特性,第三节 口腔组织工程与干细胞,一、组织工程的基本原理,修复缺损器官的方法自体移植异体移植组织代用品,组织工程的基本原理和方法 组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖,扩增,然后移植到人体内所需要的部位,从而达到器官修

24、复或再造的治疗目的的一种技术.,组织工程的核心问题是：建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体,优点：形成具有生命力的活体组织用最少量的组织细胞修复大块组织缺损任意塑形,组织工程的关键技术:组织构成细胞的培养 生物组织是由实质细胞和间质细胞构成。对于组织工程来说，首先要求获取所要培养组织的细胞。细胞可来源于自体细胞，这是一种较常规的选择，可以避免机体的免疫排斥反应，但是受到种类、数量、时间等限制。因此必须考虑其它方式来获取细胞，如应用治疗性克隆技术从胚胎干细胞诱导分化成组织特异干细胞或应用转基因技术获得工程细胞。获取细胞后，还要研究细胞扩增防老化技术及其机理，干细胞快速、规模扩增等问题。,生物

25、材料及构架制备 为了形成具有三维结构的组织，必须提供一个构架，构架选择的聚合体必须有足够的弹性提供细胞一个类似生命体的力学环境，充分多的孔隙允许培养液浸润生长的组织，传输营养物质和清除细胞代谢废物，随着组织的生长能够自我降解，但是降解速度不能太快，要有足够的时间保证细胞长进去，及时填补聚合体溶解留下的空隙。所以必须用多分支的、多孔渗水的聚合物材料制作网络构架，常用的有聚羟基乙酸、聚乳酸类等生物材料。其关键技术主要包括基体材料改性、表面修饰、表面活性组装、降解速率调控、三维构架设计和制备等等。,良好的生物相容性生物降解性良好的表面活性具有多孔性,组织工程支架材料的要求：,生物组织工程化培养系统的

26、研究 力学环境(微环境应力分布)是诱导、调控细胞功能分化，影响细胞能动运动、粘附、聚集以及细胞之间的相互作用，进而决定其生物图式的构成的重要因素。另一方面，细胞的生长要求一定的化学微环境。在离体培养条件下，化学微环境稳态的维持必须通过特殊设计的传质过程实现。而传质过程总是和介质的应力分布耦合在一起的。因此，组织工程中的细胞组织培养系统和生物化学工程中传统的生物反应器有质的区别，它的研究涉及组织工程学的一些基本的科学问题，而它本身又是组织工程的关键技术之一。,二、口腔干细胞研究,干细胞（Stem cell）即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡

27、。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。,概念,全能干细胞多能干细胞单能干细胞,按分化潜能,按发育状态,胚胎干细胞成体干细胞,干细胞的分类,成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人心的部分。它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面的争论。,成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,牙髓干细胞牙乳头干细胞,三、组织工程学在口腔医学中的应用,在颌面重建中的应用 引导口腔组织再生 组织工程化粘膜在口腔医学中的应用 用于人造涎腺的初步研究,