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1、第七章 固定化细胞和酶Immobilized cells and enzymes,酶催化剂的优点：专一性强，反应条件温和，反应速度较快。弱点：溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶稳定性差，易失活。,1969出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。,固定化酶生物反应器,实际应用中，固定化酶可以装在反应器中，连续生产有利于生产的自动化，提高生产率。鉴于此，70年代以来，该技术受到各国学者的瞩目，纷纷开展固定化酶的研究。,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的性质,一、固定化的原则和方法由于酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心
2、。固定化时，活性中心的必需基团避免参加反应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定化反应。,固定化方法：,载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶性载体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。,载体结合法交联法包埋法,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质,交联法：使酶与具有两个以上官能团的试剂（戊二醛）进行反应，应用化学键把酶固定。,包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、
3、胶原、卡拉胶等。包埋法简单，可适用于大多数酶。,二、固定化酶和细胞的性质,1、固定化后的活性 酶经固定化后，活力降低。原因是：a.酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或多或少地参与了结合，使得酶的结构发生部分变化，酶活力有一部分丧失。b.由于载体的存在，有空间位阻，影响底物和酶接触，酶的活性得不到全部表达。细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞内酶受细胞膜、壁的保护。,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质,固定化酶结构的改变,2、稳定性 酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶分子的结构或细胞被约束，对外部恶劣环境的敏感性下降，使其稳定性增加（对热、对各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的幅
4、度比较大。,3、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,a.底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶或细胞对底物专一性变化不大。,b最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，有的不变化，有的向pH小的方向移动，有的向pH大的方向移动。,3、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,c.反应的最适温度 固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升高的幅度不同，215 oC不等。,d.动力学常数 酶：米氏常数km反映了酶和底物的亲和力。固定化酶的表现Km(app)与游离酶的Km相比有些不变，有的变化很大。,3
5、、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,原因可能是：载体间的静电作用，以及扩散效应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部液相主体溶液高，Km(app)下降。相反，用包埋法的固定化酶的Km(app)值，可较游离酶多两个数量级。这是由于凝胶中的扩散效应使底物浓度减少，导致内部底物浓度低于外部区域的浓度，Km(app)上升。对于固定化细胞，情况类似。Vmax 一般不变化。,8.2 固定化酶和固定化细胞的应用,在70年代初，首先固定单一的酶，催化单一反应；随后同时固定两种酶或两种以上的酶，以及固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应；再后来发展起来的固定化细胞技术，使得不易提取的不稳定的酶的利用
6、有了方便条件，还可以利用活细胞的完整代谢体系来完成复杂的反应。如乙醇的生产。,8.2 固定化酶和固定化细胞的应用,在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来的亲和层析技术，已经远远超出了 利用酶和微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。,固定化酶和细胞技术的显著特点：1连续反应；2获得的产物纯度高；3固定化酶或细胞可重复使用，减少 了浪费；4易实现自控。,应用实例：DL-氨基酸的光学拆分 人体只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸在食品医药领域的应用非常广泛，并且需要量不断增加。化学合成法是生产氨基酸的方法之一，该法成本低，但生产出来的氨基酸是DL 外消旋体。要想把L-
7、氨基酸分离出来，需要进行光学拆分。,复习几个概念：,外消旋体：对映体的右旋体和左旋体等量混合后，它们的旋光性相互抵消，不再有旋光性。这样的混合物称为外消旋体，以D、L表示。外消旋体可以用适当方法拆开或分开。,复习几个概念：,外消旋化：在一般情况下，和不对称碳原子相连的四个原子或原子团，不能随意调换位置，因此对映体不能相互转换，旋光度维持不变。但在热、光、或者化学试剂的影响下，不对称碳原子上的原子或原子团可发生调换现象，使旋光物质转化为它的对映体，最后得到外消旋体，原来100%的左旋体，经变化后，变成50%左旋体和50%的右旋体，这种现象称为外消旋化。,DL-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它是利
8、用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高的L-aa，且收率高。,氨基酰化EDL-R-CHCOOH+H2O L-R-CH-COOH+D-R-CHCOOH 不对称水解 NH2 NH2 NHCOR 溶解度小酰化-DL-aa L-aa 酰化D-aa,外消旋化,外消旋体,固定化酶光学拆分DL-氨基酸生产流程,1969年，日本千钿一郎成功地利用固定化酰化氨基酸水解酶，由酰化-DL-氨基酸连续生产L-aa获得成功。这是世界上固定化酶在工业生产上应用的第一个实例。各种光学活性氨基酸都用这种方法生产。该项技术成功的关键是制造出适合于工业化要求的固定化酶。,果葡糖浆的生产,葡萄糖不能直接代替蔗糖，因甜度不够，但葡萄糖和果糖是同分异构体，葡萄糖可以异构为果糖。Glucose fructose+Glucose高果糖浆的甜味是蔗糖的2倍。这一应用是目前世界上使用固定化酶规模最大的生产上的实例。,高果糖浆,葡萄糖异构酶,
