《基因工程相关技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程相关技术.ppt（40页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第五章:基因工程基本技术,主讲教师:杨应斌 答疑电话,基因工程概论,酶切,电泳技术,鉴定,重组载体,引言,本章内容,核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备,核酸琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳原理与操作,核酸的琼脂糖凝胶电泳注意事项,准备干净的配胶板和电泳槽,选择电泳方法,适合的电泳缓冲液,电泳的合适电压和温度,DNA样品的纯度和状态,DNA的上样,Marker的选择,凝胶的染色和观察,正确选择凝胶浓度,准备干净的配胶板和电泳槽,注意:DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象,选择电泳方法,一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶
2、电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。,适合的电泳缓冲液,常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。,注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。,电泳缓冲液配制,正确选择凝胶浓度,浓度通常在0.52之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。,电泳的合适电压和温
3、度,电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象,DNA样品的纯度和状态,注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。,正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。,DNA的上样,Marker的选择
4、,DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。,凝胶的染色和观察,实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBRGreen，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。,本章内容,核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PAGE原理,Acr(单体丙烯酰胺),Bis(交联剂),TEMED(加速剂),AP(催化剂过硫酸铵),以此凝胶为支持物的电泳称PAGE。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（）,PAGE注意事项,（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧
5、固定螺丝，避免缓冲液渗漏。（2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。,本章内容,核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备基因组DNA的提取与纯化RNA的提取与cDNA合成,琼脂糖凝胶DNA片段的回收,琼脂糖凝胶DNA片段的回收,操作流程,本章内容,核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备基因组DNA的提取与纯化RNA的提取与cD
6、NA合成,感受态大肠杆菌的制备,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理,感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易接收外源状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,Ca2+,经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理,感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，
7、我们把处于易接收外源状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌,钙磷复合物,用天平准确称取下列物品并置入一个洁净的100毫升三角烧瓶中:胰蛋白胨 1g浓缩酵母浸出粉 0.5gNaCl 0.5g1.5g的琼脂粉,LB平板培养基配制,在烧瓶中置入一磁力搅拌棒并加入100毫升ddH2O溶解上述物质,然后磁力搅拌混匀.用棉塞塞住瓶口,并用牛皮纸封住扎紧后,将烧瓶于120消毒20min.,LB平板培养基配制,消毒结束后,在超净工作台内将培养基倒入消过毒的平皿中(培养基的厚度为35毫米).侍培养基冷却凝固后,于4中保存备用.,LB平板培养基配制,细菌划线培养,取一块无抗菌素的LB平板培养基,在超净工作台内,用细菌
8、接种环挑取细菌,于培养基上作蛇形画线.,细菌划线培养,将平板置入37培养箱中倒置培养1216小时,然后取出观察有无菌落长出.,从37培养1620h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的1620h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中。于37振摇培养约23h（旋转摇床200300r/min），每隔2030min测量OD600值0.4。,1.在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷 的 50ml聚丙烯离心管中，冰上放置1020min 2.于44000转/分离心10min，回收细菌细胞 3.将管倒置1min，以使最后残留的痕量培养液流尽,离心,
9、5.以10ml用冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，44000转/分离心10min，回收细菌细胞；6.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2(内含15%甘油)重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70贮存备用。,离心,100ul/管,分装,低温冻存,注意事项,1.所用器具的洁净程度,2.培养基的装量：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。,3.培养基的pH值。接种前的pH值在，菌摇好后，不要低于6.0，最好在6.5以上。,4.培养后的OD600值=0.6,5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。,20分钟后离心,100ul/管,分装,注意事项,MgCl2,MgCl2 20mM,6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用,注意事项,7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。,注意事项,8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱。,注意事项,本章结束，同学们现见！,
