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1、基因扩增实验室常用仪器设备的使用和维护,卫生部临床检验中心 王露楠,PCR热循环仪（DNA扩增仪）高速(冷冻)离心机漩涡振荡混旋器恒温水浴箱/恒温金属浴洗板机（PCR-ELISA)酶标仪(PCR-ELISA)加样器,PCR热循环仪（DNA扩增仪）,PCR扩增仪的原理及发展状况：PCR扩增仪原理 国内常见扩增仪简介 国内常见荧光定量PCR仪简介PCR扩增仪的使用与保养,PCR扩增仪的原理及发展状况（1）梯度水浴法,变性:如94C,退火:如55C,延伸:如72C,（2）空气驱动循环恒温装置,本系统力求降低部件的成本，用空气作为热传导媒介。装置包括机箱（外壳）、热源、冷空气源、控制器和辅助电器元件等
2、部分。优点：不用金属的精密加工，成本降低。整个系统没有液体流动，不用致冷液，因而安全程度高。恒温精度可达1。缺点：单纯靠外部空气制冷，受环境温度影响。,（3）变温金属块作恒温装置,加热方式有电热发热、半导体发热，制冷方式有半导体制冷和压缩机制冷等多种方式。国外产品的特点是产品质量和性能较稳定。机型：适用，建议 8*12孔德模式。,国内常见扩增仪简介,T11-II型基因扩增仪（华美生物工程公司）温度设定范围：室温-99C样品批量能力：480.5ml或161.5ml离心管动态显示内容:实时温度、到计数时间、到计数循环数主要功能：整机全自动化运行，线性运动臂同时具有自动和手动功能；具有断电恢复功能；
3、可贮存128个用户文件。,2400型DNA扩增系统(美国应用生物系统公司）,最大样本数：可同时扩增3*8个0.2ml PCR反应管。温度范围：4-99.9加热冷却速度：样本实际升降温速度平均为1/秒。静态样本均衡性：0.5，35-100范围。温度精度：35-100间误差小于0.75。特点：所附加热盖保证防止样品蒸发，无需加石蜡油操作，满足最小5l体积；扩增反应的要求；可储存68个PCR方法，每个方法包括PCR前处理，保温，PCR循环及PCR扩增后保温条件；断电后有自动启动功能。,PTC-200 热循环仪（MJ公司产品）,最大样本数：多样本载板可选择，其中包括扩增96个0.2ml PCR反应管。
4、温度范围：-5-105加热速度：样本实际升温速度为3.5/秒。温度精度：孔间温度差异小于0.3。特点：采用可调压力和高度的热盖，防止样品蒸发，无需加石蜡油操作；三种温控选择：模块、样本内参或电脑模拟计算。,Eppendorf梯度PCR仪,最大样本数：是唯一可同时防置0.2ml和0.5ml反应管的扩增仪，可同时扩增96个0.2ml PCR反应管和77个0.5ml反应管。温度范围：4-99加热速度：3/秒。冷却速度：2/秒。温度准确性：0.2。特点：循环时可对变性、退火和延伸同时设温度梯度。,PCR扩增仪的使用与保养,PCR仪应放在临床基因扩增实验室的第三区。仪器应放置水平台上，电源电压须与仪器要
5、求电压相一致，并连接可靠的地线。仪器远离水源、明火及腐蚀性物质。工作室温要求：15-25，通风保证散热。接稳压电源。尤其是半导体升温降温的设备。每次实验时，最好能将扩增仪内的孔位全部放置样品管，若样品管少时可用空管代替，以保证实验的一致性和重复性。,PCR扩增仪的使用与保养,实验结束后应及时擦干孔位内呆能存在的水分，盖上机盖。应定期使用电子测温仪校准温度。水浴式扩增仪应及时补充水，以免水量过少，影响温度稳定性。定期清洁热盖和反应孔。,国内常见荧光定量PCR仪简介,GeneAmp 5700型荧光定量PCR仪Lightcycler 荧光定量PCR系统ABI 7000型荧光定量PCR仪杭州博日 Li
6、ne-gene,LightCycler(Roche),Rotor-Gene(Corbett Research),ABI Prism(Applied Biosystems),GeneAmp 5700型荧光定量PCR仪,仪器特点外标定量，熔点曲线分析。5700采用基于CT值之实时动态荧光定量PCR方法，结果重复性好，线性范围广，可分别用于TaqMan 荧光探针技术作定量PCR和SYBR Green荧光染料作定量PCR。一次最多可同时分析96个样品，荧光检测波长范围530-590nm。,GeneAmp 5700型荧光定量PCR仪,影响测定结果的因素域值设定光路维护加样的准确性和反应体系的均一性反应管
7、中是否有气泡反应管不符合荧光检测要求或疏水性差反应管或反应槽被荧光物质污染反应管用记号笔做标记,Lightcycler 荧光定量PCR系统,原理和特点可使用外标法定量，可加内对照，可做熔点曲线分析。单一光路的三个检测点对样本同时进行三个波长的荧光检测，扩赠与检测同时进行，提供实时分析和在线监测。引入独特的颜色补偿试剂和软件以消除个检测通道其它染料荧光的干扰。一次可做32个样本。公用热室，保证单次PCR个样本的状况连续一致。循环速度快，20-30分钟完成30-40个循环，一次检测样本数32个。,Lightcycler 荧光定量PCR系统,清洁和维护反应槽和内壁均可用家用洗涤剂清洁，但反应槽必须在
8、取出后才能进行清洁。当毛细管破碎时，首先用仪器厂家提供的毛刷将碎片去除，再用70%乙醇清洗反应槽。光路部分须用无水乙醇清洁,ABI 7000型荧光定量PCR仪,检测原理和特点采用精确的化学原理和多组分计算方法，可准确检测和处理PCR指数级扩增的数据，得出高精度重现的Ct值，多色荧光检测，实时数据监控，并有熔点曲线分析。荧光波长范围500-660nm，可分别用于TaqMan 荧光探针技术作定量PCR和SYBR Green荧光染料作定量PCR。,杭州博日 Line-gene,检测原理和特点内标定量和外标定量，激发光波长470nm，荧光检测波长530nm、640nm和710nm。对PCR扩增全过程进
9、行实时动态监测。一次最多可同时分析33个样品，最大循环数为99。,高速(冷冻)离心机,使用方法注意事项维护和保养,使用方法,离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。,注意事项,机体应始终处于水平位置，外接电
10、源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。开机前应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。样品应预先平衡。离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危险物品。挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。,注意事项,易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能离心。在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的、放射性的物质或病原微生物。离心机运行时不可人为地打开盖子。如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则应立即停止使用。使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。如果被离心的物品密度大于说明书的规定范围，应根据RCF
11、计算公式，减小离心体积。,维护和保养,转头应定期清洗和消毒。擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。使用消毒液处理时，温度不可超过25，时间不可超过规定时间。可以用高压消毒的转头，应在清洗后，121 消毒20分钟，转头务必平放，并不受挤压，以免变形。每次操作完毕；应作好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。,洗板机,机理及主要类型国内常见洗板机简介选购洗板机的注意事项洗板机使用中注意事项,机理及主要类型,简易型也可称为手动式洗板器，一般由负压泵与清洗头，可完成最基本的吸液，也有可完成加液动作的装置。这类装置，由于成
12、本极低，使用方便，工作量不大时可以使用。自动式洗板机：可根据用户的设置完成规定次数与条数的洗板工作，有的具有简单的存贮功能。主要目的是利用自动化技术，替代手工劳动。其中有条式与板式之分。如LABSYSTEM的W4、BIO-RAD早期的1250、拓普公司的DEM-2等。集成环境式洗板机特点在于提供良好的洗板环境，强调洗涤效果而非自动化，具有一定的智能特性，如LABSYSTEM的ACSENT WASH，拓普的DEM-3等。,国内常见洗板机简介,适用微孔板清洗头加液量(uL)残留量(uL)浸泡时间震动两点吸液底部冲洗洗液种类,选购洗板机的注意事项,关键指标：残留量3uL。能否提供可选择的洗板环境。是
13、否对国产试剂盒具有兼容性与扩展性。考察仪器的可靠性与洗涤效果的可靠性。售后服务是否及时、价格是否合理。,洗板机使用中注意事项,有一定的洗涤次数：多次洗涤有利于取得好的效果，一般不超过6次。注意每孔的加液量；以加满为宜，一般为每孔350微升建议在洗涤前进行位置调节，吸针要到微孔底部，以降低残留量。建议用户采用两点吸液与底部冲洗方式，以得到好的洗涤效果。洗涤结束后，不能像常规ELISA扣板；每天使用完毕后应冲洗管路及清洗头。定期维护、检修仪器及配件。,加样器,基因扩增实验室应备有4套连续可调加样器，分别用于试剂准备、样本处理、扩增和产物检测四个试验区。,加样器,加样器的类型P型移液器的型号和取液范
14、围加样器的使用P型移液器的应用范围P型移液器技术指标加样器的校准,加样器的类型,单道连续可调式移液器多通道连续可调式移液器单道连续移液器单道移液管配合使用的移液器,P型移液器的型号和取液范围,型号 所用量程范围（L）GILSON eppendorfP2 0.1 2P10 0.5 10 0.5 10 P20 2 20 2 20P100 20 100 10 100P200 30 200 20 200P1000 200 1000 100 1000,加样器的使用,吸液的位置,把按钮压至第一停点垂直握持移液器，使吸嘴浸入液样中，浸入液体深度视型号而定：P2和P10 1mmP20和P100 2-3mmP2
15、00和P1000 2-4mmP5000 3-6mmP10ML 5-7mm,设定容量值,P型移液器的应用范围,P2，P10:超微量计量及移液，应用于DNA定序及酶分析等。P20，P100，P200和P1000应用于一般水溶液、酸、硷的计量和移液。P5000和P10ML大体积移液和计量。,P型移液器技术指标(1)(GILSON),型号 容量 准确度（标准误差）精度（重复性）2(L)绝对误差(L)相对误差(%)标准误差(L)相对离差(%)P2 最小 0.2 0.024 12 0.012 6 0.5 0.025 5 0.012 2.50 最大 2 0.030 1.5 0.014 0.70P10最小 1
16、 0.025 2.5 0.012 1.25 5 0.075 1.5 0.030 0.60 最大 10 0.10 1 0.040 0.40P20 最小 2 0.1 5.0 0.03 1.50 5 0.1 2.0 0.04 0.80 10 0.1 1.0 0.05 0.50 最大 20 0.2 1.0 0.06 0.30,P型移液器技术指标(2)(GILSON),型号 容量 准确度（标准误差）精度（重复性）2(L)绝对误差(L)相对误差(%)标准误差(L)相对离差(%)P100 最小 20 0.35 1.8 0.10 0.5 50 0.4 0.8 0.12 0.24 最大 100 0.8 0.8
17、0.15 0.15P200最小 50 0.5 1 0.2 0.40 100 0.8 0.8 0.25 0.25 最大 200 1.6 0.8 0.30 0.15P1000 最小 200 3.0 1.5 0.6 0.3 500 4.0 0.8 1.0 0.2 最大 1000 8.0 0.8 1.5 0.15,P型移液器技术指标(3)(eppendorf),型号 容量(L)不准确度(%)不精密度(%)P10 最小 0.5 5.0 2.8 1 2.5 1.8 最大 10 1.0 0.4P20最小 2 5.0 1.5 最大 20 1.0 0.3P100 最小 10 3.0 1.0 最大 100 0.8
18、 0.2 P200 最小 20 2.5 0.7 最大 200 0.6 0.2P1000 最小 100 3.0 0.6 最大 1000 0.6 0.2,加样器的校准,校准环境和用具要求：室 温：2025，测定中波动范围不大于0.5。电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平内的湿度（相对湿度60-90%），天平内应放置一装有10 ml蒸馏水的小烧杯。小烧杯：510 ml体积。测定液体：温度为2025的去气双蒸水。选定校准体积：拟校准体积；加样器标定体积的中间体积；最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。,校准步骤：将加样
19、器调至拟校准体积，选择合适的吸头；调节好天平；来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头垂直握住加样器，将吸头浸入液面23 mm处，缓慢（13秒）一致地吸取蒸馏水；将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体；将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一 档，等待13秒，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出；记录称量值；擦干吸头外面；按上述步骤称量10次；取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按附表所列蒸馏水Z因子计算体积。按校准结果调节加样器。,注意事项,根据所需取液量选择相应的移液器及吸头，基因扩增实验要求使用带滤芯的吸头，防止交叉污染。吸取液体时应缓慢匀
20、速吸取，避免液体溅到移液器头上；打出液体后拇指不应松开按钮，将吸液嘴压掉后再将拇指松开，避免液体回吸。在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。连续可调式移液器不可在无吸头时使用，吸头有液体时不可平放或倒置。,注意事项,操作时要慢和稳，吸嘴浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变；改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸嘴；发现吸嘴内有残液时必须更换；新吸嘴使用前应先预测。为防止液体进入移液器套筒内，注意以下几点：压放按钮时保持平稳；移液器不得倒转；吸嘴中有液体时不可将移液器平放；P5000及P10ML移液器一定要加过滤芯。切勿用油脂等润滑活塞或密封圈。使用了酸
21、或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。,注意事项,连续可调式移液器在取样加样过程中应注意移液嘴不能触及其他物品，以免被污染；移液嘴盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。连续可调式移液器在使用完毕后应置于以液器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。在取液之前，所取液体应在室温（15-25C）平衡；液体温度与室温有异时，将吸嘴预洗多次再用；移液温度不得超过70。不可把容量计数调超其适用范围。,维护,加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：1一般维护可用中性洗涤剂（如洗餐具用的洗涤灵）清洁，或者用60%的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。2如果有液体进入加样器内的严重污染，可以将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书（不同的加样器的拆开方式有所不同）。3高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒（121及1巴压力下消毒20分钟），如Eppendor的Research单道可调加样器。但消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变型。4各区（试剂准备、样本提取、扩增和产物检测）的加样器应有各自的标识，清洁和消毒 时，应分别处理。,谢谢,
