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1、基因的克隆与表达,基因克隆(gene cloning)基因表达(gene expression)-原核基因表达-真核基因表达,基 因 克 隆 Gene Cloning,概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程,一、概述,确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码,1973年Cohen完成第一个基因工程实验,经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌,所需元件：限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞,基因克隆（分子克隆molecular cloning）-通过体外重组技术,将一段
2、目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。,基因克隆的核心-体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。,基因克隆的技术路线 目的基因 载体,体外重组,重组子（杂合DNA）,转化,受体细胞,筛选阳性克隆,大量扩增，获得子代DNA,二、克隆载体,复制基因(replicator)选择性记号克隆位点,三、受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性,四、体外重组的策略1、粘末端连接1）全同源粘末端连接 最方便简单 高背景
3、-载体自身环化 双向插入,2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略粘-粘连接：最有效、最快捷粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平,2、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低，酶用量大,3、人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段,4、T-A克隆T-vector两条链的5端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A,五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得1、直接分离3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示,1、直接分离DNA适用于克隆原核生物的基因组文库,2、构建基因组文库
4、，筛选目的基因基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。,构建流程,抽提基因组DNA,鸟枪法制备DNA片段,DNA片段与载体重组,转化宿主菌,筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）,特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况,3、构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合
5、成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。,cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选,4、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法,5、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differential display,DD)筛选差异表达的基因,（二）体外重组连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18 平末端连接：室温（低于30)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3酶量：
6、平端连接时需加大酶量,（三）转化Cacl2法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）原位杂交2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR方向鉴定：联合酶切测序,基因的表达 Gene Expression,一表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。,据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。,二原核生物基因结构和表达特点,原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形
7、成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。,3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。,操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位,原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。包括：调控区(调节基因，启动基因，操作基因)、结构基因,5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子终止子,启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。一般长40-60bp，富含A-T碱基对具有
8、保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT-35区：,RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录各种启动子启动转录能力不同。启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列,终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列,6、与转译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点转译起始密码子AUG 或GUGSD顺序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11 bp长约3-9bpmRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列,三外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确
9、开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解,四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。,常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受噬菌体CI基因负调控。温度诱导。,2、基因剂量：3、核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3末端互补程度。AUGSD间距离。AUG后的核苷酸,五原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控
10、基因,类型：融合型表达载体：-融合蛋白非融合型表达载体：-天然完整蛋白分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙,（一）融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,技术关键：克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点加人工合成的DNA接头构建位相载体,-ATG-AAC CTG GAA TTC CTA GGT-TAC-TTG GAC CTT AAG GAT CCA-,EcoRI,BamHI,AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA,载体部分序列,DNA序列,位相载
11、体-含有3种读码框的系列载体,优点：表达效率高产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性,Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白直接纯化产物切割方便：pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子位相载体,融合型载体-pGEX系列,（二）非融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,主要元件：强启动子 SD：ATG：第一个密码子,非融合型表达载体-pPL-Lamda,PL启动子-温度诱导插入位点-HpaI,（三）分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜
12、2、优点：分泌表达，避免降解。,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,分泌型融合表达载体-pEZZ18,六提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子-提高转录水平核糖体结合位点（ATG-SD）避免产物降解：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂,2、选择合适宿主 Lac 启动子-LacI菌PL/PR-CI857 溶源菌,3、诱导表达 温度诱导-PLPR/IPTG的化学诱导-Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解,七表达产物的检测：1、特异性鉴定：荧光抗体法免疫沉淀法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定,八、原核表达系统的缺点1、没有转录后加工系统，不能识别
13、、剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工,真核表达系统的必要性及优势1.具转录后加工系统2.具翻译后修饰系统3.可实现真正的分泌表达4.基因治疗,真核基因结构及表达调控特点（一）真核基因组的复杂性真核基因组庞大，具大量非编码序列-mRNA丰度不同结构复杂：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样不连续性：内含子、外显子没有操纵子结构,(二）真核表达系统组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式,据受体细胞及表达载体的不同分为3种：酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统,（三）转化1、原生质体法：去除厚壁2、电穿孔法：效率较高,（四）外源基因的表达1、胞内表达2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列,（五）缺点不能实现全部的翻译后修饰功能,
