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1、第四节 梭菌（Clostridium）检查法,梭菌属有130个种，多数为腐生菌，约有25-30种能引起人和动物致病。这些致病菌能分泌外毒素和侵袭性酶类。临床上的致病性梭菌主要有破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等。,一、梭菌概述,梭状芽孢杆菌病,（一）梭菌形态特征Morphological properties,粗大芽孢杆菌，（0.4-1.2）m(3-8)m，杆状或稍弯曲，单独存在或呈短链状排列。革兰氏阳性周生鞭毛形成的芽孢比菌体宽，在菌体的中央或近端，少数菌种的在菌体顶端，但多数在菌体中部膨大呈梭形。,（二）培养特性 cultural properties,大多数专性厌氧，但耐氧性变化很大p
2、H6.5-7，30-37 生长快多数为化能有机型有的能固氮触酶试验多为阴性模式种为丁酸梭菌对磺胺药、青霉素、土霉素等较为敏感。,（三）检查方法 Test method,1.厌氧培养冷触媒法：取适宜容器3个1个放入氢硼化钠或氢硼化钾0.22g，产氢1个放柠檬酸0.33g，碳酸氢钠0.37g,产CO2另一个放活化的钯粒1g，冷催化临用前与培养管、厌氧指示管一同放入装置中。取水各5mL加入前两个试剂容器内，立即封闭装置等厌氧指示管（美兰）达厌氧状态时，移入37培养箱培养。,焦性没食子酸法：取适宜容器一个，内装焦性没食子酸10g，无水碳酸钠5g，与已接种的培养管、厌氧指示管一同放入装置中。立即封闭装置
3、，等厌氧指示管达厌氧状态时，移入37培养箱培养。,凡士林-石蜡封盖法：在已接种的培养管内注入已经灭菌并液化的1：1的凡士林-石蜡混合物1cm高度，试验管经75-80水浴保温时，凡士林-石蜡混合物自动熔化并封住液面，冷却后置37培养。在培养过程中可随时取出培养物作检查。,降低培养基的氧化还原电势添加还原剂：盐酸半胱氨酸、硫乙醇酸钠，甲醛化次硫酸钠，葡萄糖，VC，硫化钠，金属铁，组织等吸收培养基中的氧。培养基煮沸添加琼脂：减少对流，防止空气进入,2.消除杂菌干扰,在做梭菌检查时，常将接种后的液体培养基在75-80保温20-30min，以杀灭可能存在的细菌繁殖体。加入新霉素、卡那霉素、多粘菌素,3.
4、形态学检查,在早期培养时，革兰氏阳性，但24h以上的培养物易染成阴性，因此要注意培养时间对梭菌属细菌要观察芽孢的存在、位置、形态，革兰染色时，菌体着色，芽孢不着色。凡经厌氧培养的芽孢杆菌，都是梭菌属，但产气荚膜梭菌、多枝梭菌等难以形成芽孢。染色未检出芽孢时，进行耐热试验。,二、产气荚膜梭菌（C.perfringens）,普遍存在于土壤、水、食品、调料、肠道中在食物中生长到每克106个以上才有致病性，至少摄取108个以上才可能致病在肠道中产生芽孢肠毒素是一种芽孢特异性蛋白，在出芽过程中产生。,（一）生物学特性,1.形态特征粗大芽孢杆菌，（0.8-1.0）m(4-8)m，杆状或稍弯曲，单独存在或呈
5、短链状排列。革兰氏阳性无鞭毛不运动芽孢卵圆形，不膨出菌体，位于菌体中央或次极端有明显的荚膜,2.培养特性,厌氧，但要求不严格在血平板上，产生双圈溶血环，内环（）完全溶血，外环（）不完全溶血，菌落本身略灰黄或灰褐色，与空气接触30min后，可能变为灰绿色或鲜绿色。一般不形成芽孢，碱性环境易产生芽孢培养基中有可发酵产酸的糖类时，不形成芽孢繁殖快，在适宜条件下8min一代,3.生化反应,发酵糖类产酸产气液化明胶还原硝酸盐产生硫化氢不产生吲哚代谢产物为酸或醇Stormy-fermentation,4.致病性,产生12种外毒素，其中四种为致死毒素。有些毒素本质是酶类。根据外毒素的种类不同，可将本菌分为A
6、、B、C、D、E 5个型。对人致病的主要是A和C，A常见。A型菌产生的肠毒素可引起食物中毒，作用类似霍乱肠毒素。A型菌侵入伤口引起急性坏疽，致死率40-100%C型产生的毒素可引起急性坏死性肠炎。,(二)产气荚膜梭菌半定量测定,以最大可能数（MPN）法测定菌数利用乳糖亚硫酸盐培养基和倒管，加入梯度稀释的样品液，混匀后45-46厌氧培养24-48h。试管内有黑色的硫化铁形成同时倒管中有大量气体时，表明有产气荚膜梭菌存在。查表可知其最大可能数。,45-46 厌氧24-48h,（三）特征性生化试验,1.动力-硝酸盐还原试验：穿刺接种两管培养基，37厌氧培养24h，观察有无动力。检查一管的亚硝酸盐反应
7、，滴加a-萘胺试液及对氨基苯磺酸试液各0.5mL，红色或桔红色表示硝酸盐被还原成亚硝酸盐。梭菌为阳性反应,45-46 厌氧24h,a-萘胺,对氨基苯磺酸各0.5mL,注意：加试剂后，立即判断结果 未接种前应检查有无硝酸盐存在 反应在厌氧条件下进行，分装培养基时，液层应有一定的高度。,2.石蕊牛乳试验 Litmus Milk Reactions,产气荚膜梭菌在牛乳培养基中能迅速分解乳糖，产酸，将酪蛋白凝固，产生大量的气体，冲散凝固的酪蛋白，出现“汹涌发酵现象”。5h之内不发酵为阴性反应,3.乳糖分解-明胶液化试验,将待检菌穿刺接种乳糖-明胶培养基，35-37培养24-48h，取出置冰箱5-10m
8、in和阴性管对照，观察乳糖明胶的分解情况。该菌能发酵乳糖，有气泡产生且培养基的颜色由红变黄，并在48h内液化明胶。,4.卵磷脂酶试验与奈格尔（Nagler）试验,原理：产气荚膜梭菌产生的A型毒素是一种卵磷脂酶，能使卵黄培养基中可溶性的磷脂酰胆碱分解为磷酸胆碱和不溶性的二脂酰甘油酯，后者在菌落周围形成不透明区，此即卵磷脂酶试验阳性。此反应可被相应抗血清抑制，如果在接种前先于平板上涂布抗卵磷脂酶抗体血清，则菌落周围形成透明区，称为奈格尔试验阳性。,方法：将卵黄平板分成两半，其中一半涂上产气荚膜梭菌抗血清，37待干后，将待检菌轻轻在平板上划线，由不涂抗血清的一半划向涂过抗血清的一半，在厌氧条件下37
9、培养24-48h，观察结果。,结果：在接种待检菌未涂抗血清的一侧，菌落周围有不透明区，表示卵磷脂酶试验阳性。涂抗血清的一侧，菌落周围无不透明区，表示卵磷脂酶活性已为其特异的抗血清中和，为奈格尔试验阳性。如两侧菌落均无不透明区，为卵磷脂酶试验阴性。问题：抗血清不易获得,检样25g+营养肉汤,均质、离心、稀释,菌落10个,倾注平板,3724h厌氧,确证试验,镜检,动力,硝酸盐还原,左卵磷脂分解,肠毒素检测,热抵抗,血清分型,报告,3724h厌氧,牛乳发酵,破伤风梭菌是人类破伤风的病原菌。大量存在于人和动物的肠道，由粪便污染土壤。侵入伤口生长繁殖，释放外毒素，引起痉挛性抽搐，导致窒息或呼吸衰竭死亡。
10、发展中国家，新生儿破伤风死亡率90%。用于深部组织、创伤、溃疡的制剂不得检出,三、破伤风梭菌（Clostridium tetani）,1.形态与染色 Morphology and stain菌体细长，0.5m(2-5)m，直杆菌，无荚膜，周生鞭毛；芽孢球形、端生成鼓槌状，是显微鉴别的重要特征。G+，但在芽孢形成后，易转变成阴性,（一）生物学特性 Biological properties,2.培养特性 Culture characteristics专性厌氧；生长最适温度37，45不生长；最适在血琼脂平板上，呈扩散生长，不易获得单个表面菌落；37培养48h，菌落直径2-4mm，扁平、半透明、灰白
11、色，边缘不齐，周边疏松呈羽毛状，有狭窄的溶血环在庖肉培养基中，肉汤轻度混浊，碎肉消化，发黑恶臭,厌氧小瓶和注射器非营养型运送培养基阻止氧气扩散维持生存72h含指示剂系统，有氧时变为淡紫色,3.生化反应 biochemical reaction,一般不发酵糖类，偶尔分解葡萄糖液化明胶产硫化氢多数菌株吲哚试验阳性不还原硝酸盐对蛋白质有微弱的消化作用,4.抵抗力 Resistance,芽孢抵抗力强，在干燥的土壤和尘埃中数十年不死，可耐煮沸1h，干热150度1h。对青霉素、磺胺类敏感耐氨基糖甙类抗生素,5.抗原构造 antigenic structure,各型间O抗原相同，H抗原具有型特异性，可分为1
12、0个血清型。各型菌所产生的毒素生物活性及免疫活性均相同，可被任何型抗毒素中和。,（二）致病性与免疫性 Pathogenic and immunity,1.致病物质-外毒素破伤风痉挛毒素tetanospasmin（神经毒素neurotoxins）：成分为蛋白质，引起横纹肌痉挛。现已制成结晶毒素，对小白鼠的最小致死剂量为0.1mg/kg，可致痉挛窒息死亡。抗原性强，甲醛处理可制成类毒素，注射机体可产生抗毒素。溶血毒素：溶解红细胞,2.所致疾病Disease caused by C.tetani,破伤风 tetani 细菌不侵入血液，仅在局部繁殖。产生的痉挛毒素进入血液引起毒血症。毒素与对人及某些动
13、物的中枢神经有特殊的亲和力，与神经节苷脂结合，导致骨骼肌痉挛性收缩牙关紧闭，苦笑面容，颈部、躯干及四肢肌肉持续强直性痉挛导致角弓反张，呼吸困难，窒息死亡,3.免疫性 immunity,病后免疫力不强，再感染时仍可发病。患病早期使用抗毒素治疗同时，注射类毒素。,（三）检验方法 Test method,1.增菌产毒培养：取供试品0.5g或2mL，分别加至0.1%葡萄糖庖肉培养基中（内有倒管）。同时做阳性对照和阴性对照。以上各管培养基均经75-80水浴保温20-30min，以杀死其他细菌营养体，并刺激破伤风梭菌形成芽孢。移入厌氧装置37培养72-96h。,结果：阳性对照管的培养液混浊，产气，碎肉被消
14、化变黑色并伴有恶臭；样品管可有可无此现象；阴性对照管无菌生长。,2.革兰染色镜检 Gram stain and microscopy,革兰染色时为阳性，24-48h即可形成芽孢，芽孢初生时卵圆形，形似火柴或网球拍状。继而膨大成球状。72h后菌体自溶仅存芽孢体。,3.毒力试验 virulence test,选用体重相同的同性健康小白鼠18-30只，分成3群，每群分成2组。每组3-5只，分别作毒力试验及破伤风抗毒素tetanus antitoxin保护试验。毒力试验组:在小白鼠后腿内侧肌肉或背侧颈部皮下注射增菌产毒培养液0.3-0.5mL注射6h后观察发病情况至48h，由破伤风外毒素引起的中毒症状
15、为强直性痉挛，抽搐，尾巴僵直竖立等症状，死亡。,抗毒素保护试验组:在注射培养液前先注射120u/mLmL半小时后注射增菌产毒培养液。或等量混合后注射。6h后与试验组同时观察发病情况。,结果：任何一次试验组毒力试验呈上述病状，保护试验组无上述症状而存活的，说明有破伤风梭菌存在，毒力试验阳性。试验组与保护试验组均无症状的，则毒力试验为阴性。,4.分离培养 isolate and culture,在培养液中镜检发现疑似破伤风梭菌，而毒力试验阴性时，应将培养液划线接种于新霉素葡萄糖血琼脂平板，37厌氧培养3-4天，挑取典型菌落，再连续转种于增菌产毒培养基中两次，以增加毒力，再取该培养液作毒力试验。,5
16、.结果判定 result and analysis,毒力试验阳性，无论镜检是否检到破伤风梭菌，均按检出论。毒力试验阴性则按未检出论。,（四）注意事项 note,进行破伤风菌检验的人员应事先注射破伤风毒素进行免疫，操作时勿损伤皮肤凡带有活菌与毒素的器具应彻底灭菌后洗涤庖肉培养基的配制最好使用1：3的新鲜牛肉汤控制庖肉培养基的pH值不低于7.3,供试品,75-80,20min,0.1%葡萄糖庖肉培养基,36,72-96h,产气、臭气、消化碎肉、阳性,非左,报告,毒力试验,阳性,阴性,0.1%葡萄糖庖肉培养基,36,72-96h,毒力试验,阳性,阴性,0.1%葡萄糖庖肉培养基,毒力试验,分离培养,3
17、6,72-96h,0.1%葡萄糖庖肉培养基,36,72-96h,毒力试验,阳性,阴性,其它方法,用荧光染料标记的破伤风抗O免疫诊断血清染色镜检接种至血琼脂斜面底部，37厌氧直立培养24-48h,从上部挑纯菌半抗毒素鉴别法,抗毒素鉴别法,四、肉毒梭菌（C.botulinum）,肉毒梭菌为腐生菌，常见于土壤、水环境的沉积物中，很少引起感染。罐头、火腿、腊肠、鱼及鱼制品、发酵豆制品和面制品中若污染肉毒梭菌并产生毒素，引发毒素型食物中毒。,添馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、抄洋葱、蜂蜜制品美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，我国多与发酵食品有关重症患者多在2-4天死亡。,4 1 m的大杆菌4-8根周生
18、鞭毛，运动迟缓无荚膜适宜温度25-35适宜pH为菌落3mm，半透明，表面颗粒状，边缘不整齐，界限不明显，向外扩散，呈绒毛网状,在血平板上出现溶血环在乳糖卵黄牛乳平板上，菌落为乳浊，表面及周围形成虹彩薄层不分解乳糖，发酵葡萄糖分解蛋白的菌株，菌落周围有透明环菌株间生化性状不规律,（一）生物学特性 Biological properties,（二）致病性 pathogenic,1.致病物质肉毒毒素botulin是已知最剧烈的毒素，毒性比氰化钾强1万倍，比响尾蛇毒素约高10万倍。纯化结晶的肉毒毒素1mg可杀死2 亿只小鼠，人注射0.0003mg，经口0.3mg。根据毒素的抗原性不同，可分为A、B、C
19、1、C2、D、E、F、G 8个毒素型，A、B、E、F 对人类致病，A、B 最常见。我国大多为A型。不耐热，煮沸1min可破坏。,肉毒毒素是一种神经毒素，阻止向胞外分泌和释放乙酰胆碱。导致无法应答运动神经元的冲动，肌肉不能收缩，松弛麻痹。,肉毒毒素作为治疗药剂从自然界毒性最强的蛋白质获益自1989年FAD批准A型肉毒毒素用于治疗3种障碍性疾病：斜视、眼睑痉挛、半侧面部痉挛其它方面的震颤、美容、偏头痛、紧张性头痛等正在进行的研究有：梭菌毒素或毒性结构域用于药物配送、预防食物中毒、治疗癌症和其它疾病,2.所致疾病 Disease caused by C.botulinum,肉毒中毒botulism：
20、常发生于毒素摄入后18-24h，出现乏力、头痛，复视、斜视、视力模糊、眼睑下垂、渐进性吞咽和说话困难、声音嘶哑、肌肉无力、也许会出现腹涨和便秘。最终引起膈肌麻痹，死于呼吸障碍或心脏衰竭。治疗依赖于辅助性护理和多价抗毒素的使用。,婴儿肉毒病 感染性食物中毒。一岁以内特别是半岁以内的婴儿，肉毒梭菌在肠道内繁殖并产生毒素，毒素经肠道吸收而致病。大多在1-3个月内自然恢复，病死率不高。美国每年有约100例婴儿肉毒中毒，蜂蜜和灰尘。表现为便秘、无精打采的、大多虚弱、仅是很少。常常死于呼吸衰竭。,三种梭菌的比较,（二）肉毒梭菌检验,增菌培养 取庖肉培养基3支，煮沸10-15min 第一支，急速冷却,接种检
21、样均质液1-2mL第二支，冷却至60，接种检样，60保温10min，急速冷却第三支，接种检样，继续煮沸10-15min,急速冷却30 培养5天10天若有生长，上清液进行毒素检验,分离培养,增菌产毒培养物接种卵黄琼脂平板，35厌氧培养48h典型菌落隆起或扁平，光滑或粗糙，菌落表面有虹晕色（iridescence）,此光区称为“珍珠层”C、D、E型菌落表面通常有2-4mm黄色沉淀区围绕，A、B型菌落沉淀区较小挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，30 培养5天进行毒素检验和培养特性检查,接种卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35的需氧和厌氧条件下培养48h肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长病形成
22、特征菌落，在需氧条件下不生长,培养特性检查,检样,增菌、产毒培养305天,观察并镜检,报告,毒素检测,镜检,分离培养,报告,毒素检测,毒素检测,增菌、产毒培养305d,观察并镜检,（三）肉毒素检验程序及方法,检样制备,液体检样直接离心，固体或半流动检样需加适量的明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，离心，取上清取上清液，调pH6.2,每9份加10胰酶水溶液1份，混匀，3760min，检测。,毒素检出,取上清液及胰酶激活处理液分别注射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4天注射后24h内发病，死亡症状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，呼吸麻痹,确证试验,取毒素三份1份加等量多型混
23、合肉毒抗毒诊断血清，混匀，3730min1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4天。,毒力测定,却确定含有肉毒毒素的检样离心上清液用明胶磷酸盐缓冲液稀释5倍、50倍、500倍、5000倍，分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4天。根据动物死亡情况，计算检样中的大体毒力（MLD/mL）,定型试验,按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10-1000 MLD/mL的范围分别与各单型肉毒抗血清等量混匀，37作用30min分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4天以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清,与稀释毒素液等量混合作为对照能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样所含肉毒素的型别,（四）注意事项,典型的肉毒中毒，小白鼠会在4-6h内死亡，98-99的会在12h内死亡24h后的死亡可疑如注射更高稀释度的样品后未死亡，可疑肉毒中毒必须以检出食物中的肉毒毒素为准,
