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1、实验四 常用的生化反应,实验目的,认识染色方法鉴别细菌的局限性掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断,实验菌种,产气肠杆菌（Enterobacter arogenes）大肠埃希菌（Escherichia coli）普通变形杆菌（Proteus vulgaris）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）,糖发酵试验,细菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，可借以鉴别细菌。一般非致病菌能发酵多种单糖，如大肠埃希菌能分解葡萄糖和乳糖，产生甲酸等产物，并有甲酸脱氢酶，可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气，以“”表示。伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸，但无甲酸脱氢酶，故生化结
2、果为产酸不产气，以“+”表示。伤寒沙门菌不能分解乳糖，以“-”表示。,O-F试验,将实验菌种接种到2支O-F管中在其中1支管中加入无菌液体石蜡，厚度0.5cm左右。35培养18-24小时。结果开口管 加石蜡管 结果黄色 黄色 发酵型（F）黄色 绿色 氧化型（O）绿色 蓝色 产碱型,VP试验,产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇被氧化（在碱性溶液中）生成二乙酰，后者可与含胍基的化合物反应生成红色化合物，称VP试验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，VP阴性。VP甲液：5%萘酚VP乙液：40%KOH,甲基红试验,产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液pH5.4，甲基
3、红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性pH5.4，指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。,枸橼酸盐利用试验,能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，由此使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。,吲哚试验（靛基质）,含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚（靛基质），若加入对二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。,硫化氢试验,变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成
4、硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。,尿素分解试验,变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色。,阳性阴性尿素酶试验,吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为IMViC试验。大肠埃希菌呈“+-”，产气肠杆菌为“-+”。,硝酸盐还原试验,原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而
5、形成亚硝酸盐和其他还原性产物。,硝酸盐还原的过程因细菌不同而异:有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。,试剂：甲液 对氨基苯磺酸 乙液-奈胺结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。,过
6、氧化氢酶试验(触酶试验),原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。试剂：3过氧化氢溶液。方法：取待测菌涂在玻片上，然后加3过氧化氢数滴立即观察结果。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。,氧化酶试验,原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。试剂：1盐酸四甲基对苯二胺或1盐酸二甲基对苯二胺。方法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。,克氏双糖铁琼脂（KIA）,葡萄糖乳
7、糖110铁：枸橼酸铁铵指示剂：酚红我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。,葡（）葡（）葡（）葡（）乳（）乳（）乳（）H2S（）乳（）克氏双糖铁琼脂（KIA）,原理,以葡萄糖，乳糖为例葡萄糖是最早利用的单糖，发酵葡萄糖的中间产物丙酮酸为酸性，酚红指示剂为黄色。,斜面,1、斜面生长的菌量多，面积大，跟氧分子接触的面积也大氧化丙酮酸 CO2H2O中性，PH不变2、斜面蛋白质被细菌利用，氨基酸被利用产生NH3，碱性，酚红指示剂为红色。,高层,高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在24小时内不会被氧化，因此仍为黄色。,结果,高层黄色斜面红色,如葡萄糖，乳糖，则高层与斜面均为黄色（24小时内）。如果延
8、长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变为红色。,有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢H2SFe 黑色的硫化亚铁,问：有无葡萄糖，乳糖的情况？为什么？,MIU试验,半固体M代表动力I代表吲哚（靛基质）U代表尿素结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二管变红为尿素阳性），然后加入对二甲基氨基苯甲醛，观察吲哚试验结果。,思考题：KIA的试验原理,实验内容,1、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征2、将四种试验细菌接种各种生化反应管：O-F管2支，KIA、MIU、硝酸盐还原各1支，葡萄糖磷酸盐蛋白胨水2支。接种完毕放置35培养18-24小时。3、过氧化氢酶试验、氧化酶试验注：以组为单位做四株试验菌，每位同学做一株菌。,
