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1、第15章核酸的研究方法,Nucleic Acid,制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用,一、核酸的分离、提纯和定量测定,真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇,（一）DNA分离纯化,制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；在RNA的反应体系内加入RNas
2、e的抑制剂（如RNasin),（二）RNA的分离,（三）核酸含量的测定,2、定糖法 RNA：核糖 糠醛 绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖+二苯胺兰色物质（595-620nm）,苔黑酚/地衣酚,浓HCl,浓硫酸,1、紫外吸收法1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA,3、定磷法 核酸含磷量为9.5%1g磷相当于10.5g核酸4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比,纯DNA 比值1.8，1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0，2.0 DNA、Pr、苯酚污染,（四）、核酸纯度
3、的测定,OD260OD280,二、核酸的沉降特性与超速离心,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来,8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力=0+4.22（r2-r02）10-10：浮力密度：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离,（一）核酸密度的测定,G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10,（二）测定DNA的G-C含量,RNADNA变性DNA双链DNA 蛋白质，变性程度越大
4、，浮力密度越大,（三）研究核酸的构象,（四）用于核酸的制备,超螺旋DNA或,用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。,三、核酸的凝胶电泳,（一）琼脂糖凝胶电泳,用于小片段DNA的分析相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析时不会分解样品。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,（一）DNA的酶法测定,四、核酸的核苷酸序列测定,英国 Sanger1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。,末端终止法Sanger2，3双脱氧核
5、苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。,MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA,DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP,（二）DNA的化学法测序：由Maxam和Gilbert所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱,4组特异的反应如下：（1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂（2）G+A反应：用甲酸
6、使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基（4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂,32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG,硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG,肼/Nacl（C）：*
7、AC*ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（C+T）：*AC*ACT*ACT T*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG,从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。,32P*ACTTCGACAG,（三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个：（1）用酶特异切断RNA链：（2）用化学试剂裂解RNA（3）逆转录成cDNA,1995年K.Mullis发明。基本步骤为：1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.优化反应体系：包括适量模板、引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+,五、DNA聚合酶链式反应（PCR）,3.选择3个温度进行热循环：变性94，4560s；退火，根据引物的Tm，1min；延伸，72，1min。循环4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果,y=产物；x=扩增效率；n循环次数,模板DNA（单链）引物DNA聚合酶（Taq）dNTPMg2+,MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION,六、DNA的化学合成,P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护,
