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1、第三节 酶的分离方法,一、沉淀分离,二、离心分离,三、过滤与膜分离,四、层析分离,五、电泳分离,六、萃取分离,沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关。,一、沉淀分离,常用的几种沉淀分离方法,1、盐析沉淀法,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。,优点：成本低，不需要特别昂贵的设备操作简单、安全对许多生物活性物质具有稳定作用
2、,（1）基本原理,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。,（2）中性盐的选择,溶解度大：硫酸铵在0时仍 有70.6%（质量分数）的溶解度，远远高于其它盐类。,几种盐在不同温度下的溶解度（g/100ml水）,分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可能除去75%的杂蛋白，纯度提高了4倍。不易引起变性，有稳定酶的作用：有些酶用2-3mol/L的硫酸铵保存可达数年之久。价格便宜，废液不污染环境,（3）盐析的操作方法,最常用的是固体硫酸铵加入法。,研磨硫酸铵成细粉,边搅拌边缓慢均匀少量多次加入,冰浴,离心,过滤,加盐速度尽量
3、慢，避免局部硫酸铵浓度过大而造成蛋白质变性,低浓度,高浓度,（4）盐析的影响因素,蛋白质浓度：2.5%-3.0%（质量分数）较适中，相当于25-30 mg/mlpH值：常选在该酶的等电点附近温度：对温度敏感的酶，要求在0-4下操作，以避免活力丧失,盐析时注意事项：酶不同，结构不同，所需盐浓度不同。另外，酶的来源，杂质等也对其有影响。盐析后的酶含大量盐分，要进行脱盐处理,2、有机溶剂沉淀法,原理：降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。优点：分辩能力比盐析高沉淀不用脱盐缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需
4、在低温下进行。,（1）有机溶剂的选择和浓度计算,原则：能与水互溶常用试剂：乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸等常用的是乙醇）计算公式：V=V0(S2-S1)/(100-S2),需要加入量,原溶液体积,原溶液中有机溶剂的体积,有机溶剂终体积,加入有机溶剂的体积分数（纯溶液体积分数为100%）,（2）有机溶剂沉淀的影响因素,温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。注意！大多数酶在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性！样品浓度：通常使用5-20mg/ml的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的分离效果。pH值：选在等电点附件，提高分辩能力离子强度：不超过5%为宜。乙醇溶液不超过
5、原溶液2倍体积为宜。,离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同分子大小、密度的物质分离的技术。,二、离心分离,1、基本原理,F=m2r,当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。,2、相对离心力,RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力/F重力=m2r/mg=2r/g g为重力加速度（980.7cm/sec2)RCF=1.11910-5(r/min)2 r,3、离心机的主要构造和类型,（1）制备性离心机分为三类：A、普通离心机最大转速6000r/min左右，最大相对离心力近6000g，容量为几十毫升至几升，分离
6、形式是固液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质。Eg：红细胞、酵母细胞等。,B、高速冷冻离心机最大转速为20000-25000r/min，最大相对离心力为89000g，最大容量可通到3L，分离形式也是固液沉降分离。,一般有制冷系统，离心室温度可调节和维持在0-4，转速、温度和时间都可严格控制。,C、超速离心机转速可达50000-80000r/min，相对离心力最大可达510000g,（2）转子,转子类型固定角式转子(fixed-angle rotor)水平转子(swing-out rotor)垂直转子(vertical rotor)带状转子(
7、zonal rotor)连续转子(continuous rotor)转子的材质铝质：较轻,耐受强度较弱,适合在较低的转速下使用;不锈钢：耐受强度最好,但材质本身太重；钛合金：耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。,A、固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40之间。常见的角度 20 28 34 40,角式转子的特点重心低,转速可较高样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径“管壁效应”：有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。,设40000rpm时R1最小、3.8cmR2平均、5.9c
8、mR3最大、8.1cmRCF值分别67,910g 105,400g144,700g,R1,R2,R3,在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不相同,B、水平转子（1）转子静止时,处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行,（2）转子旋转加速时,离心管中心线由 行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成90角,（3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致有少量的“管壁效应”,水平转子的特点转子的重心位置较高样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径对于多种成分样品分离特别有效常用于速率区带离心和等密度离心,3、离心方法,（1）差速沉降离心法分离两种以上大小，密度不同的颗
9、粒。操作方法：分离较大颗粒 分离较小颗粒适用范围：大小、密度相差较大的颗粒优点：操作简单、方便缺点：分离效果差，沉淀中有杂质，沉淀后颗粒在底部易受挤压,上清加大转速和分离时间,例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞 500g,10分钟 沉淀 上清液(细胞核）10,000g,10分钟 沉淀 上清液(细胞膜碎片,线粒体,)100,000g,3小时 溶酶体 沉淀 上清液(核糖核蛋白体）(可溶性成份),（2）差速区带离心法（密度梯度离心）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数不同的颗粒相互分离的方法介质：梯度介质形成梯度范围，不与样品反应，不使样品凝集、变性或失活。常用：蔗糖浓度：5%-60%；密度：1.02g/cm3-1.28kg/cm3,操作方法：,加样,离心,收集,小心放在梯度溶液表面,不同颗粒形成若干条带,虹吸或切割离心管等方法,（3）等密度离心分离密度不同的颗粒，在离心力作用下上浮或下沉。常用介质：铯盐。如CsCl、Cs2SO4等操作方法：,混匀样品与介质,离心,分离,4、离心机操作注意事项,必须事先在天平上精密的平衡离心管和其内容物。依据不同离心液体选择不同离心管，每次检查转头低于室温离心时，要先将转头预冷离心过程中不得随意离开了解转头最高离心转速和使用积累限时。,
