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1、琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,学习动物的处死与组织匀浆的方法。学习离心机的使用方法。进一步理解酶的竞争抑制原理。,实验目的：,实验原理：,竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色）作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可
2、指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。,06,二、实验原理,抑制剂和底物的结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底物复合物的形成。,酶的竞争性抑制作用,抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例（I/S）,HOOCCH2CH2COOH,HOOCCH=CHCOOH,FAD,FADH2,MBH2甲烯白（无色）,MB甲烯蓝（蓝色）,在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变。,草酸HOOCCOOH,琥珀酸脱氢酶,实验器材与试剂:,（一）试剂pH=7.4的磷酸缓冲液0.25%琥珀酸钠溶液0.5%草酸钠溶液0.01%甲烯
3、蓝溶液生理盐水液体石蜡,实验器材与试剂：,（二）器材研钵.手术剪.手术镊子2mL移液管1000 uL微量可调仪器10mL离心管低速离心机,实验操作：,(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充分研磨至糊状 分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml 搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟 将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液,实验操作：另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定,摇匀，静置于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并分析产生该现象
4、的原因。,1肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里2离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置3离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊,注意事项：,思考题：,1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在摇动?避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲烯白重新氧化成甲烯蓝,思考题：,2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本实验成功的关键是什么？,思考题：,3：抑制剂还可以选用什么物质？还可以选用丙二酸4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶
5、的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。,思考题：,5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺陷与改进方案？,补充：,琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受体的，另一种是作用于所有受体。,琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法 2.铁氰化钾K
6、3Fe（CN）6还原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法,1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：SuccinatePMSFumaratePMSH2；PMSH2DCPIPPMSDCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度
7、可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算SDH的活性。SDH活性计算：（标准测定）/标准=mol/min/mg。,2.铁氰化钾K3Fe（CN）6还原法 以铁氰化钾K3Fe（CN）6和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6再与Fe3作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。,3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为人造受氢
8、体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出TTC-脱氢酶活性,4.MTT法 MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazana），经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度570nm处OD值推测出活细胞的数目。,5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法 N
9、BT易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而形成紫蓝色的沉淀，于反应体系中加入PMS，混匀，37保温30min，之后加入TCA终止反应。加异丙醇溶解显色，混匀，即可于548nm测OD值。规定：30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。,竞争性抑制的机理,竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；抑制剂与酶的结合部位（活性中心）与底物与酶的结合部位相同；抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；动力学参数：Km值增大，Vm值不变。抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例注意：结合在酶的同一部位以及结构类似并不是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位阻碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以造成竞争性抑制。,琥珀酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的一个重要部分，其它酶大多存在于线粒体的基质，作用于有氧呼吸过程。作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶（markerenzyme）之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标，对于评价精子线粒体功能、研究致奶牛酮缺乏症病理过程等具有重要意义。,感谢您的关注,
