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1、汇报人：张妍妍指导老师：张松 刘新利汇报日期：2011-10-22,生物转化小组技术报告,主要内容,一、薄层层析法（TLC）二、硅胶柱层析分离,一、薄层层析法（TLC）固-液吸附色谱优点：设备简单，分析速度快；高分辨能力，结果直观。根据薄层层析硅胶型号分为：硅胶 H、硅胶 G、硅胶 HF254和硅胶 GF254，要求粒径为 540m。（氧化铝）用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01g）的分离。,TLC正相，极性大的物质先分离出来，极性小的后分离出来。,1：比移值Rf 小，极性强2：比移值Rf 大，极性弱或非极性,（1）薄层板的制备,玻璃板：平整、光滑、洗净后不附水珠。调浆：一般30g硅胶加入
2、100gCMC-Na水溶液（0.3%0.5）顺时针研磨，至无气泡。硅胶比例大，CMC-Na水溶液有沉淀，板易裂。涂布：薄层要尽可能均匀光滑，厚度固定（根据实验需要来确定）,0.251mm存放：室温晾干！硅胶板110活化30min，氧化铝板在200220烘4h，放于干燥器中。,（2）点样,样品的溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯。含水量越小越好。点样：点样斑点越小越好，直径一般以24mm为宜，可重复点样。点样要轻，不可刺破薄层。点样量：样品太少，斑点不清楚，难以观察；样品量太多，往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。电吹风吹干或干燥器内晾干。,（3）展开剂的选择及配制,展开剂的选择：Rf值在0
3、.150.85之间。常用溶剂及相对极性：甲醇乙醇异丙醇乙氰氯仿乙酸乙酯二氯甲烷乙醚正己烷、石油醚 强极性溶剂 中等极性溶剂非极性溶剂 强极性：三氯甲烷/甲醇 弱极性：丙酮/石油醚混合溶剂极性高/低=1/3（V/V）Petroleum ether/Ethyl acetate,Petroleum ether/Acetone,Petroleum ether/CH2Cl2,CH2Cl2/ethyl acetate,MeOH/ethyl acetate,CHCl3/ethyl acetate,展开剂的配制：新鲜配制，把各组成溶剂移入分液漏斗，使混合液充分混匀。展开剂的饱和：双槽的展开缸 缸内蒸气饱和时间
4、在30min左右，防止边缘效应。切勿使样点侵入展开剂中。放板时动作要快。展开剂前沿上升到样点上方810cm时取出薄层板。,（4）温湿度的控制通常温度越低分离越好，用空调或冰柜控制；湿度影响板的吸附能力，在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。（5）显色（显色剂：通用、专属）喷雾显色：雾化器，均匀细雾状浸渍显色：专用玻璃器皿或玻璃缸蒸气熏蒸显色：双槽玻璃缸（碘蒸气显色）（6）检视装置 三用紫外仪253.7nm下观察,薄层色谱定性定量方法,定性方法1.利用Rf定性：用标准品对照2.板上化学反应定性：根据所用的显色剂及颜色定量方法1.直接定量法：比较样品和标准品斑点的面积大小颜色及颜色深浅。目视或用薄层扫描
5、仪。2.间接定量法：抠下斑点，洗脱，用分光光度计比色洗脱液,二、硅胶柱层析分离,原理：物质在硅胶上的吸附力不同，极性大的易被吸附，吸附解吸附。硅胶H的处理：活化：110 烘箱干燥 l h 脱气：加入干硅胶体积一倍的溶剂 注：硅胶柱不能遇水，吸引水分子形成水膜，影响分离效能。,硅胶柱分离时洗脱剂选择：,根据文献报道，尝试比例调整。据TLC展开剂比例再稀释一倍！氯仿：甲醇=9:1（18:1）被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂，被分离物质为强极性成分，则须选用强极性溶剂为洗脱剂。极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；加一点点
6、三乙胺，氨水等碱性物质来中和硅胶的酸性拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。,装柱（最大影响因素！）,湿法装柱和干法装柱，上表面一定要平整，一次性倾入。要求填充均匀，无断层、无缝隙、无气泡硅胶的高度一般为15cm左右（长、粗）,据情况而定 柱子径高比一般在 1：510平衡柱子（3-4个柱体积的洗脱剂）,上样,柱内的溶剂液面降至吸附剂表层时开始上样干法上样：样品溶解性差 样品+少量洗脱剂+少量硅胶 拌匀后烘干 优点：样品层较平整。湿法上样：用少量展开剂将样品溶解，沿柱内壁均匀加入。加完样后在样品层上再加入一层硅胶，防止冲散样品层。,洗脱并收集（TLC跟踪）,梯度洗脱：极性缓慢增大样品收集：如果被分离各组分有颜色，根据色层收集洗脱液。如果各组分无色，先等分收集(自动收集器)，然后用TLC逐一鉴定，再将相同组分的收集液合并在一起，浓度。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。,硅胶柱层析分离过程中，对洗脱液进行TLC检测，如下：,最后的处理：,送谱分析前，用少量的溶剂洗涤一下，去除杂质。必要时进行重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，可除去氢谱 1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。,Thank you for your attention!请各位老师和同学提出宝贵的意见和建议。,
