《病理学技术的应用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《病理学技术的应用.ppt（42页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、吕自力简介,女，汉族，硕士导师，副教授19911996年广西医科大学临床专业学士19961999年广西医科大学病理专业硕士2003-2006年中山医科大学病理专业博士1999-至今工作于广西医科大学QQ 489506642电话：，5356534（办公室）,病理学常用技术在科研中的应用,广西医科大学第一附属医院病理科吕自力,尸体剖检 autopsy,gold standard 活体组织检查 biopsy,frozen sections.细胞学检查 cytology,（一）人体病理学的诊断和研究方法:ABC,（二）实验病理学的研究方法,动物实验 animal experiment组织和细胞培养 t
2、issue&cell culture,病理学的研究方法,病理学的形态观察方法和新技术,大体观察组织学和细胞学观察组织化学和细胞化学免疫组织化学超微结构分子生物学技术流式细胞术计算机图象分析技术,qualitative,quantitative,病理学的应用范围,病因学研究发病学的研究基本病理变化揭示疾病的本质、进行病变诊断、分类、分期以及预后判断药物选择与疗效观察新药开发,内 容,免疫病理学技术,常规HE染色及特殊染色,分子病理学技术,一、HE染色在科研中的运用,1、HE染色的用途,1）组织结构特点,2）细胞形态特点,2、HE染色流程,固定取材 脱水,包埋 切片 染色 观察,3、HE染色注意事
3、项,1）标本采集,组织尽可能多尽量获取未坏死组织 尽量避免挤压组织 标记标本的方位,3、HE染色注意事项,2）固定,A.及时固定（离体30分钟内）B.固定液：10%的中性福尔马林固定；C.骨髓活检、睾丸活检标本也可用Bouin液固定 D.电镜标本用2.5%戊二醛固定 E.固定液与标本体积比应大于10：1 F.固定时间：2-4小时（小），12-24小时（大）,二、特殊染色在科研中的应用,1、目的1）识别病原体：HP,抗酸，PAS,特殊染色的用途,2）识别组织：Masson,VG,PAS,三、免疫组织化学Immunohistochemistry,IHC,原 理使用范围试剂配置操作步骤,免疫组织化学
4、的原理,抗原+抗体-显色,原位,半定量,蛋白,用途,临床病理诊断：肿瘤分类诊断 上皮来源：CK，EMA 间叶来源：Vimentin 淋巴组织:LCA科研：组织抗原表达情况,试剂准备,切片(防脱片),多聚赖氨酸,APES,一抗,多抗or单抗,兔or鼠,注意种属特异性，针对检测组织种属,检测试剂盒,EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法）SP试剂盒（三步法）SABC试剂盒（三步法）,显色试剂盒,DAB试剂盒,其他,H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清,操作步骤,组织切片脱蜡，水化,PBS洗3次 X 3分钟,抗原修复,一抗（37
5、度1h，4度过夜）,封闭内源性过氧化物酶,PBS洗3次 X 3分钟,二抗（37度30分钟）,PBS洗3次 X 3分钟,苏木素染核,自来水洗,DAB显色,脱水,封片,PBS洗3次 X 3分钟,结果分析和判断,阴性,CK胞浆阳性,细胞核阳性-PCNA,胞膜阳性,注意事项,（1）判断原则（2）对照设计（3）非特异染色（4）失败的原因及其处置方法,（1）判断原则,必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,（2）对照设计,阳性对照：已知阳性表达的组织自身对照：同一标本中不同组织对照阴性对
6、照：A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照,（3）非特异性染色,原因,组织内源性成分的干扰：内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞内源性生物素-肝、胰、肾组织,组织处理不当：内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞内源性生物素-肝、胰、肾组织,（3）非特异性染色,处理方法,抗体：纯化，浓度，时间，温度,封闭：H2O2，非免疫动物血清,清洗：充分,显色：时间,其他：脱蜡充分，无干片,（4）染色失败的原因及处理方法,试验片：-阳性对照片：-阴性对照片：-空白对照片：-,结果：假阴性,原因：操作步骤？试剂？,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：+,结果：假阳性,原因：切片干
7、涸抗体浓度过高缓冲液配制不对冲洗不彻底显色液配制不对显色时间过长载玻片的粘合剂过厚,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：+,结果：假阳性,原因：非特异染色，与二抗交叉反应。,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：-,结果：可疑阳性,原因：阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：-,结果：阳性,原因：方法可靠，实验片含靶抗原。,阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性,原因：标本固定不当抗体试剂问题：浓度、效价低抗原修复不当显色时间短,切片染色深或整张切片出现染色,抗体浓度过高切片显色时间过长组织没有正确封闭冲洗不够充分,切片出现非特异性背景染色,内源性过氧化物酶、内源性生物素过多血清封闭时间过短抗体不纯组织片内出血或坏死成分冲洗不彻底,四、免疫荧光技术,将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对 抗原进行细胞定位,免疫荧光技术,五、分子生物学技术原位杂交,分子生物学技术原位杂交和原位PCR,HPV DNA&CK,组织芯片,病理学技术,杂交,
