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1、第二章 分子克隆载体与宿主 Vecotrs and Host Cells,主要内容,第一节 分子克隆载体的特点第二节 大肠杆菌克隆载体第三节 真核细胞的克隆载体第四节 宿主系统,第一节 分子克隆载体的特点,1.载体的定义2.分子克隆载体的功能3.发展概况4.载体的特点5.遗传标记基因,1.分子克隆载体的定义,分子克隆载体(vector)是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子,2.分子克隆载体的功能:,为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞的复制或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力,3.发展概况,第一阶段（1977年前）：天
2、然质粒和重组质粒的利用 如pSC101,ColE1,pCR,pBR313 第二阶段：增大载体容量，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因 第三阶段：进一步完善载体的功能以满足基因工程克隆中的不同要求,4.载体的特点,至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞至少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA插入具有较小的分子量和较高的拷贝数具有对受体细胞的可转移性,提高载体导入受体细胞的效率,5.遗传标记基因,标记基因的作用标记基因的种类常用的标记基因,标记基因的作用：指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细
3、胞 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,标记基因的种类：抗性标记基因 营养标记基因 生化标记基因,常用的遗传标记基因,四环素抗性基因（Tcr）抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。,氨苄青霉素抗性基因（Apr）杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。,氯霉素
4、抗性基因（Cmr）抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。,卡那霉素(Kanr)、新霉素(Neor)、G418抗性基因(G418r)杀菌剂，Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上，导致mRNA发生错读。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ）半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 其氨基末端称为链，羧基末端称为链 链负责将
5、链装配为四聚体 单独的链不具酶活性，只有在链的帮助下组装成4才具有酶活性-互补作用 为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs),半乳糖苷酶基因的优点,酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactosideLacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量的大 通常以 LacZ作为载体的遗传标记基因，而由 宿主细胞表达链,葡萄糖苷酸酶基因（GUS）-葡萄糖苷酸酶可将X-Gluc降解为兰色产物 适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因,荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生，可催化荧光素氧化，并产生荧光 或由发光细菌（Photo
6、bacterium fischeri）产生,绿色荧光蛋白基因（GFP）GFP是由水母产生的一种可发光的蛋白质,问题,1.一个质粒含有四环素抗性基因（tetr）和LacZ基因，tetr内有一Hind III位点，LacZ中有一EcoR I位点。如用这两种限制性核酸内切酶切割载体一并连接入相应的外源片段，则带有该重组质粒的细胞将（）。A.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现蓝色 B.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现蓝色 C.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现白色 D.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现白色,2.LacZ基因通常用于构建质粒载体的目的是什么？（）A.编码一种限制性内切核酸酶，
7、在转化细胞时用于切割载体 B.编码蓝色色素产物，可用于示踪转化的细胞 C.编码一种酶，将RNA转化为DNA D.编码一种抗生素抗性的酶 E.编码一种可检测的酶，当基因内部的位点插入任何外源片段，ORF遭到破坏时，产物即不能表达。,第二节 大肠杆菌克隆载体,主要内容,一.质粒载体二.载体三.cos 质粒四.细菌人工染色体,质粒载体,1.质粒的基本特性2.质粒的改造、构建与使用3.质粒的分类及用途4.常用的质粒载体,1.质粒的基本特性,质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双链DNA分子(1500 kb)(Covalently closed circular D
8、NA,cccDNA),Plasmids:smaller cycles of double-strand DNA that do not carry essential genes,1).具有自己的复制起始位点(Origing)(ori)和控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立复制子(Replico)结构。2）可扩增性。严紧型复制质粒(Stringent)每个细胞复制1-5 个质粒拷贝。松弛型复制质粒(Relaxed)具有高拷贝数30-50个。,3)可转移性在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。4)选择标记的插入失活,F plasmid,5）不相容性相同
9、或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质粒的不相容性。a)两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机.b)分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。,2.质粒的改造、构建与使用,删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞)加入遗传标记基因在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列灭活某些质粒的编码基因,质粒载体克隆的一般步骤,see
10、 movie,3质粒的分类及用途,1）克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。2）测序质粒：a)高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。b)含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。,3）整合质粒：含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞后，准确重组整合在染色体的特定位置上。,4）穿梭质粒a)分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。大肠杆菌-链酶素穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。b)克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体直接从一个受体菌转移至另一个受体
11、菌中复制并遗传。,5）探针质粒a)设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，终止子。b)装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗性基因）c)缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因d)当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，报告基因才能表达。e)表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件的强弱。,6）表达质粒a)在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点（SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表达。b)大肠杆菌常用启动子：Lac,Tac,Trp 和来自噬菌体强启动子 PL,PR。它们由大肠杆菌
12、 RNA 聚合酶识别起始.,c)来自T7 噬菌体的T7 启动子。必须由T7 噬菌体来源 T7 RNA聚合酶识别起始转录。d)表达载体用T7 启动子必须用能产生T7 RNA 聚合酶的受体菌株 JM109,DE3。,问题：,4.关于穿梭质粒载体，下面哪种说法最正确（）A.在不同的宿主中具有不同的复制机制 B.在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 C.在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 D.在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率,4.常用的质粒载体,pBR322,筛选重组子的示意图,pBR322质粒载体的优点:具有较小的分子量(经验表明,为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂,克隆载体的分子大小最好不要
13、超过10kb)具有两种抗生素的遗传标记基因,易于选择重组DNA分子 具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝,pUC系列载体 是在pBR322基础上衍生出来的一系列质粒载体,pUC质粒载体的优点:具有更小的分子量和更高的拷贝数（2.7kb,500700 copies/cell）适用于组织化学法检测重组体，一步实现对阳性克隆的鉴定具有多克隆位点区（MCS）,Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA,问题,1.质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了（）。A.赋予宿主细胞某种可检测的特性
14、 B.可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离 C.独立复制的能力 D.可复制自身DNA以及插入的外源DNA E.甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解2.下列对质粒特性描述中，不正确的是（）。A.既能以单链环状又能以双链环状的形式存在 B.是独立于细菌染色体DNA以外的复制子 C.没有线性的质粒DNA D.能够自身复制。,二.载体（Lambda vector）,主要内容：,1.噬菌体的基本特点2.DNA作载体的优缺点和解决办法3.载体,1.噬菌体的基本特点,1）.是大肠杆菌温和型噬菌体2）.大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒，噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，-噬菌体悬浮液
15、加到大肠杆菌液体培养基，37C培养6小时，培养液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。,Life cycle:lytic cycle(裂解周期）lysogenic cycle（溶源周期）,1.噬菌体的基本特点,3）.噬菌斑A.噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基，37C 过夜。B.固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌仍能生长.4）.一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个噬菌体无性繁殖所产生的，是入-噬菌体DNA 用于分子克隆的基本原理。,5）.噬菌体的基因组 48514bp，线状双链DNA 线状分子两端
16、具有12n.t的5-端突起的可互补的粘性末端（cohensive end，cos），该末端称为cos位点，可被编码的A蛋白所识别 当侵入宿主细胞后，线装DNA分子借助粘性末端连接成环状分子,DNA,cos位点,cos位点,2.DNA作载体的优缺点和解决办法,优点：DNA进入细菌细胞容易 由于能裂解宿主细胞，因此提取DNA或基因表达产物都比较容易 用噬菌体颗粒包装的DNA易于长期保存,缺点及解决措施：头部只能容纳自身DNA的78-105%，即3851 Kb，天然仅可插入2.5Kb外源DNA片段除去所有与裂解无关的基因和空白区同一种限制酶有多个识别位点，不利于外源DNA插入体内突变和建立新的克隆位
17、点 重组的DNA分子难于直接导入宿主细胞利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA,3.载体,DNA 基因结构,B2区和重组基因区是噬菌体进入裂解周期的非必需区（15kb），可将该区缺失或用外源DNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响,LA 19.9 LacZ RA 21.9,LA Lac Bio RA,Charon 16A,Charon 4A,EcoRI,EcoRI,EcoRI,XbaI,Insertion vector 插入型载体,Replacement or substitution vector 取代型载体,vectors can carry DNA fragmen
18、ts up to 15kb,1.关于噬菌体，下列描述有误的是（）A.既能高效感染大肠杆菌，又能高效感染枯草杆菌 B.在成熟的噬菌体颗粒中，其DNA呈双链环状分子 C.改造成载体后，可携带较长的外源DNA片段 D.重组的噬菌体易于筛选和储存2.限制性内切核酸酶EcoR I在野生型的噬菌体DNA中有5个切点，Hind III有7个切点，BamH I有5个切点。调整这些酶切位点的数量，主要通过（）A.体内突变 B.完全酶切后连接 C.部分酶切 D.先用甲基化酶修饰后再酶切,三、cos 质粒（cosmid）,载体的容量理论上为23kb，实际有效克隆大小为15kb，可满足一般的基因克隆需要。但有的真核生
19、物基因很大，可达3540kb甚至更大,Cosmid was constructed by inserting the cos sequence of,which is necessary for packing phage DNA into phage protein coats,into a plasmid vector 在普通质粒载体中插入一个或两个来自的cos位点DNA片段（长约200 bp）,Cos质粒载体的优点：容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆具有噬菌体的特性，形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在细胞内不能形成子代噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）
20、具有质粒的特性，操作简便 对重组DNA分子长度具有选择性包装（3045kb）,Cosmids can carry up to 45kb of insert DNA,问题：,1.cosmid是一种人工构建的载体（）A.它具有cos位点，因而可进行体外包装 B.它具有质粒DNA的复制特征 C.进入受体细胞后，可引起裂解反应 D.进入受体细胞后，可引起溶原化反应2.cosmid质粒中，cos位点的功能是（）A.复制起点 B.限制酶切位点 C.参与包装进入病毒外壳 D.选择标记 E.用于筛选重组子,四、细菌人工染色体Bacterial artificial chromosome(BAC),Derive
21、d from F plasmid,can carry inserts of about 300kb,问题：,1.下面关于细菌人工染色体（BAC）的特征描述，除了（）外都是正确的。A.通过电激法将大质粒转化到大肠杆菌比酵母的转化率高了10-100倍 B.BAC载体在细菌中以环状超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易 C.BAC载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝 D.克隆到BAC载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列,第三节 用于真核细胞的克隆载体,Yeast Artificial Chromosome(YAC)酵母人工染色体 Carry 12 Mb DNA 1Mb=1,000,000 bp,Y
22、AC载体的特点：两个TEL位点，一个CEN，一个ARS（自主复制序列）三个酵母菌遗传标记基因 克隆片段大小约1MbYAc载体缺点：易出现嵌合体，某些克隆不稳定,Some possible vectors for plant and animal cells,Summary,1.下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大（）A.质粒 B.cosmid 质粒 C.酵母人工染色体 D.噬菌体 E.cDNA表达载体2.能够用来克隆32Kb以下大小的外源片段的质粒载体是（）A.charomid B.plasmid C.cosmid D.phagemid,问题,第四节 宿主系统,用于基因转移的受体菌或细胞
23、受体细胞应具备的条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除,各种基因工程受体的特性,大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子产结构复杂、种类繁多的内毒素适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,各种基因工程受体的特性,枯草杆菌遗传背景清楚，
24、蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素遗传欠稳定，载体受体系统欠完备适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌,各种基因工程受体的特性,链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢,各种基因工程受体的特性,酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定内源性蛋白产物种类繁多且含量高适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,各种基因工程受体的特性,昆虫细胞（家
25、蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定DNA重组操作系统欠完善适用于真核生物基因的高效表达,各种基因工程受体的特性,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统细胞培养条件苛刻，生长缓慢适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,各种基因工程受体的特性,植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用遗传操作繁琐适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,T
26、ypes of host cell used for gentic engineering,The type of host cell used for a particular application will depend mainly on the purpose of the cloning experimentOften a simple primary host is used to isolate a sequence that is then introduced into a more complex system for expression.,1.Prokaryotic
27、hostsE.coliBacillus（芽孢杆菌）Streptomyces（链霉菌）Pseudomonas（假单孢菌）-Shuttle vector（穿梭载体）,2.Eukaryotic hostsSaccharomyces serevisiae（酿酒酵母）PlantsAnimals,作 业,当一DNA片段插入pUC18后，在X-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果?可设计何种实验证明你的解释是正确的?,
