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1、第五章.分子生物学研究方法,第一节 基因操作的主要技术原理,1 核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。,在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核
2、酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。DNA的脉冲电场电泳技术:PFGE-Pulse-field gel electrophoresis,2 核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）,核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移
3、，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。,3 细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Com
4、petent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。,4 DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无53外切酶活性。该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP
5、，dCTP和一种ddNTP。,双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图,b DNA序列分析自动化(分析反应读片过程)用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。,DNA测序的全过程(实际),5 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。如：盒式诱变(cassette mutagene
6、sis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。,6 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.,a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay-EMSA)。,b DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）主要步骤：用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！沉淀DNA（包括
7、与DNA相结合的蛋白质）；进行DNA凝胶分析。如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。,7.PCR技术（基因的体外扩增法）,(1).概念 PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。,经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n个新生的DNA分子。,特别注意：,(2).一个PCR体系的基本组成,超纯水缓冲液Mg2+dNTPsDNA模板引物TaqDNA聚合酶,
8、(3).PCR(聚合酶链式反应)基本原理,(4).PCR的主要步骤,.高温变性 在高温（93-95）下，待扩增的双链DNA模板受热变性成为两条单链DNA模板。.低温退火 在低温（3760）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链。.适温延伸 在TaqDNA聚合酶的最适温度（72）下，以引物3-OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料，按53方向延伸,合成单链DNA模板的互补链。,(5).PCR的主要步骤小结,每一双链DNA模板，经过一轮变性（解链）、退火、延伸 3个步骤的热循环后就成了两个双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所得到的双链DN
9、A（PCR产物）均能成为下一次循环的模板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使DNA模板扩增到109倍以上，实际上一般可达106107倍。,生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程,重组DNA技术发展史上的重大事件,1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944 O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952 A.D.Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质是DNA。和提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合
10、酶I。1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960 S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于1972年获得第一个重组DNA分子，1973年Cohen第一例成功的克隆实验：完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全
11、长5387bp的噬菌体174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。,1982美、英批准使用第一例基因工程药物重组人胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1985 出现第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国
12、转基因鱼1988J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠-“Oncomouse”。1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb),1993-1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息,基因工程中常见的名词:遗传工程-genetic engineering，基因操作-gone
13、manipulation，基因克隆-gone cloning重组DNA技术-recombinant DNA technology分子克隆-molecular cloning。,一、基因工程概述 1.概念 基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。,第二节 基因工程,2.基因工程的基本程序及技术特点：基本程序：分 切 接 转 筛,基因工程的基本程序,技术特点：1.可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因重组、表达、测序、
14、诱变、修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。,3.基因工程的主要技术,DNA、RNA的分离纯化凝胶电泳技术PCR技术DNA合成技术DNA重组微生物的培养、保存酶切鉴定 DNA测序 分子杂交,4.1概念,4.基因克隆,克隆的概念,在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过程。,亚克隆的概念,是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者
15、进行重组改造等。,基因克隆 是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。,4.2基因克隆示意图,二.基因工程的要素及实施,（一）、工具酶,1.常用的工具酶的功能：,酶类名称,功能,阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年度诺贝尔生理学和医学奖.,2.一把特殊的剪刀,限制性内切酶的发现,3.限制性核酸内切酶(restriction enzyme)的分类、作用及命名,作用：识别双链DNA内部特异位点并
16、裂解磷酸二酯键分类：型、型、型命名（举例）EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序),3.限制性核酸内切酶(restriction enzyme)的识别和切割,识别和切割位点：回文结构 46 bp出现两种末端：粘性末端（粘端）平头末端（平端）,产生了平头末端,产生了粘性末端,粘性末端与平头末端,4.修饰与限制作用,活性：,5 3聚合酶活性：核酸外切酶活性：5 3外切酶活性3 5外切酶活性 DNA pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）具有5 3聚合活性和 3 5外切活性，是常用的工具酶。,5.DNA聚合酶(pol),6.DNA连接酶,7碱性磷酸酶的脱
17、磷酸作用,8.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。9.同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。,10末端脱氧核苷酸转移酶(TDT),（二）、载体（vector）,1.本质：DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达2.克隆载体的种类：原核载体：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等,3.载体的基本要求：.复制单位;.克隆位点(多个单克隆位点);.筛选标记;.分子量尽可能小;.外源DNA插入后不影响载体本身的复制能力.没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.,4.常用的克隆载体：质粒,质粒(plasmid)存在于细菌染色体
18、外的小型环状双链DNA分子。,从天然质粒到质粒载体,*大小 210kb；*优点：易于操作、保存；*缺点：转化效率较低；*转化方法：化学法 电转移法*应用：a.小基因组的克隆 b.单一序列的克隆(目的基因的 克隆),（1）质粒载体的一般特点：,（2）理想的质粒载体具有如下特点：拷贝数多;两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因(lac Z)筛选标志 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS),pBR系列 来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成。pBR322
19、是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。,（3）质粒载体举例,pUC系列 pUC系列质粒（pUC 8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。,（4）质粒电泳,OC,SC,5.常用的克隆载体噬菌体载体,（1）噬菌体(phage)的特点：.一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状DNA分子（DNA），长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。.本身有复制体系
20、;.感染大肠杆菌后要进行环化,DNA感染大肠杆菌后的环化过程,.DNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);.可人工加入多克隆位点;.筛选容易噬菌斑筛选;.主要用于DNA文库的构建.,（2）M13噬菌体 特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA 转变为dsDNA,可用作克隆载体。最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针。,柯斯质粒(cosmid)粘性质粒基本结构特征:是一种人工改造的载体,双链环状DNA组成:DNA的 cos区+质粒+控制包装作用的序列克隆容量：31 45kb,常用的克隆载体柯
21、斯质粒,4.cosmid较小,约4 6kb.5.cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.,1.具有-DNA的COS位点;2.具有质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);3.具有多种单一的酶切位点.,柯斯质粒(cosmid)的特点:,cos:cohesive-end site,柯斯质粒结构图：,柯斯质粒的优缺点:1.克隆效率高;2.可利用质粒DNA的方式扩增;3.可克隆较大DNA片段;主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建 4.缺点:产生串联现象。,YAC载体 酵母人工染色体，可容纳外源基
22、因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。,其他克隆载体：,插入型载体含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建；取代型载体含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。,经人工改造生成的基因克隆载体类型,目的基因(target DNA)的制备,目的基因（外源基因）制备基因组DNA 基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克隆载
23、体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNA cDNA文库(cDNA library)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成,文库构建 基因组文库cDNA文库 区别：材料 基因结构不同 文库内容 载体 使用范围,构建基因文库的克隆载体,粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC),基因文库的构建的步骤:,载体DNA的分离真核生物DNA的分离部分酶解片段回收(9-23 kb)载体与插入片段的连接包装文库的效价测定文库的扩增文库的保存重组克隆鉴定,cDNA文库的构建：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,高丰度,中丰度,低丰度,cDNA
24、文库的构建,cDNA文库能否构建成功的关键是:高质量的mRNA的获得一个好的cDNA文库的特征:包含有足够大量的独立克隆，代表最初的mRNA样品中的所有转录本 克隆中包含接近全长的mRNA,cDNA library construction,AAAAA,5,3 mRNA(all mRNAs in cell),anneal oligo(dT)primers of 12-18 bases in length,AAAAATTTTT,5,35,add reverse transcriptase and dNTPs,AAAAATTTTT,53,35 cDNA,add RNaseH(specific fo
25、r the RNA strand of an RNA-DNA hybrid)and carry out a partial digestion,AATTTTT,5,short RNA fragments serve as primers for second strand synthesis using DNA polymerase I,3,3,AAAAATTTTT,53,short RNA fragments serve as primers for second strand synthesis using DNA polymerase I,AAATTTTT,53,DNA polymera
26、se I removes the remaining RNA with its 5 to 3 exonuclease activity and continues synthesis,DNA ligase seals the gaps,AAATTTTT,53,AAAAATTTTT,53,double-stranded cDNA,AAAAATTTTT,53,NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAA,EcoRI linkers are ligated to both endsusing DNA ligase,AAAAANNNNNNNNGTTTTTNNNNNNNNCTTAA,double-str
27、anded cDNA copies of mRNA with EcoRI cohesive ends are now ready to ligate into a bacteriophage lambda vector cut with EcoRI,53,AATTCNNNNNNNN GNNNNNNNN,CIP:牛小肠碱性磷酸酶,粘性末端连接法（连接效率高）和去磷酸连接法,载体与目的基因的连接方法,人工接头法：,同聚物接尾法,自然界的基因转移和重组,基因重组(genetic recombination)整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制、转录和翻译。自然界的
28、基因转移和重组是无目的基因工程是有目的基因重组,结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用(transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。,转导作用 transduction,病毒、噬菌体介导溶菌途径(烈性噬菌体)；溶原途径(温和噬菌体),将重组DNA导入宿主细胞,基因工程菌 HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过
29、程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。,目的基因的筛选和鉴定方法(screening/selection),免疫学方法分子杂交 探针原位杂交 PCR限制性酶切图谱 遗传学方法插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择（蓝白斑筛选）,转化子筛选指示系统蓝白斑筛选 在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）和底物x-gal，IPTG诱导LacZ表达产生-半乳糖苷酶，-半乳糖苷酶使x-gal水解，产生兰色化合物，形成兰色菌落；当插入外源片段，使LacZ基因失活，形成无色菌斑。,IPTG:异丙基巯基半乳
30、糖苷 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),利用互补原理筛选重组体DNA分子,利用菌落颜色筛选重组子,bp1534 994 695 515 377 237,A B C M,重组DNA的酶切鉴定图谱(A:原载体;B:酶切产物;C:重组DNA;M:分子量标准,通过灭活质粒所携带的抗生素抗性基因来筛选重组DNA分子,检测重组克隆的菌落杂交技术,重组DNA技术的基本过程小结,目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定,基因工程的基本操作步骤及其应用意义,基因工程的基本操作步骤：获取外源目的基因；寻找基因载体(通常为质粒、噬菌体等)使用限制性内切酶，使目的基因与载体产生相同粘性末端，两个末端互补连接，形成重组DNA；通过转化(或感染)将重组DNA引入寄主细胞；从大量的寄主细胞中筛选出带有重组DNA的细胞进行培养。,意义：利用基因工程技术，可以大量生产在一些正常细胞中产量很低的多肽物质，用于医药等工业生产中；定向改造生物基因结构，生产抗病强、品质优的各种农副产品，以提高经济价值；用于生命科学的基础研究；值得注意的是，基因工程技术若使用不当、管理不善，也会给人类带来灾难。,作业:,1、用Sanger双脱氧链终止法进行DNA自动序列分析(即DNA测序分析)的原理。2、PCR技术原理。3、转化子的蓝白筛选原理。,
