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1、实验二 质粒DNA的分离提取,实验目的,了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。,实验原理,1946年，美国科学家Lederburg 首先研究了细菌的性因子,并于1952年由Lederburg正式命名为质粒。质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、双链DNA分子，大小可为1kb到200kb，它随寄主细胞稳定遗传。,质粒类型,质粒按复制方式分为两种类型：严紧型质粒和松弛型质粒严紧型质粒 复制要在蛋白质合成时和DNA聚合酶的存在，只随染色体的复制而复制，拷贝数少，每个细胞只有110个。,松弛型质粒 松弛型质粒的复制需要DNA聚合酶，在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10200
2、个以上的拷贝，有的甚至达到上千个。,质粒的应用,质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。,三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位,T-载体,分离质粒DNA方法,目前常用的:碱变性法煮沸法SDS法 羟基磷灰石层析法,碱变性法基本原理,在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质
3、在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器 1.恒温摇床 2.超净工作台 3.高压灭菌锅 4.高速台式离心机 5.微量取液器,（二）材料,含pGEX-4T-2质粒的大肠杆菌 JM109。,（三）试剂,1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。LB固体培养基（1
4、L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。,2.Solution 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10 mmol/L EDTA(pH 8.0)高压灭菌后，4保存备用。3.Solution(现用现配制)0.2 mol/L NaOH 1%SDS,4.Solution（100 ml）5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸（pH 4.8）。5.氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。,6.胰RNA酶 将胰RNA酶（
5、RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。7.氯仿，乙醇，70%乙醇。,质粒提取的实验步骤,1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml）中，37振荡培养过夜；2.将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心30秒，去掉上清液，重复两次；3.加入100L SolutionI 漂洗沉淀，倒尽液体；4.加入100L 用冰预冷的SolutionI,涡旋使沉淀充分悬浮，室温放置5分钟；
6、5.加入200L SolutionII，混匀（快速颠倒混匀30次，注意动作轻），室温放置2min。6.加入150L用冰预冷的SolutionIII，温和颠倒混匀（注意动作轻），冰浴放置25min。,7.12,000rpm，离心10min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 L）。6.加入等体积氯仿（约400 L），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀 2030 min。8.12,000 rpm离心15 min。,9.去上清，沉淀加入500L 70%乙醇洗涤2次（12,000 rpm离心
7、3分钟）。10.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。11.每管中加入25L无菌水1L RNase，37溶解质粒DNA。,实验结果及讨论,碱法提取质粒的注意事项,试剂盒操作方法,【实验步骤】1、将培养好的12 ml细菌12,000 rpm离心2min，去上清。2、加250 l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3、加入250 l Solution II，立即上下颠倒510次，使细菌裂解，室温放置2分钟。4、加入 400 l Solution III，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置2-4分钟。5、12,000 rpm离心，10分钟。6、将步骤5中的上清转移
8、到套放于2.0 ml收集管内的spin column柱中，12,000 rpm室温离心60秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。7、向吸附柱中加入500微升的Rnase A,12,000rpm离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。,8、向吸附柱中加入700微升的Rnase B,12,000rpm离心30秒。9、重复步骤8一次10、倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。11、将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000rpm离心1min。将吸附柱放入干净的1.5毫升的离心管中。12、在吸附膜中央加入60微升elution buffer，室温静止2min（注意，要室温，至少要满2min），12,000rpm离心1min。将所得到的质粒DNA溶液保存于-20摄氏度用于后续实验。,
