电镜冷冻制样技术NEWB.ppt

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1、第七章电镜冷冻制样技术,第一节 冷冻制样的基础知识,一 金属投影技术,二 复型技术,三 电镜冷冻制样技术概述,（一）发展概况：1946,Willams建立金属投影技术，主要用于观察颗粒材料，如病毒、细菌、原生动物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、核酸分子，以及其它非生物材料的微粒和粉末材料。1955，Hall,Huxley提出负染色技术；1959,Horne和Brenner正式命名：Negative staining，取代了金属投影技术。,一 金属投影技术,目前金属投影技术主要用于：观察不适合负染色但需要金属投影来提高反差的样品；可用于测量颗粒的大小、高度，增加颗粒的尺寸，以改善粒子在TEM的

2、可见性；是复型技术、冷冻断裂蚀刻复型技术的基础。,1.金属投影技术的概念：把具有高电子密度的金属材料（Pt，Pd,Au,Cu,Al),加热到其熔点之上，以一定的角度沉积在样品表面形成投影，从而增加样品的反差，并使图像具有立体感。,（二）、金属投影基本概念及原理：,基本过程：真空蒸发真空镀膜基本原理：有金属沉积的部位散射能力强，TEM像呈现暗区 无金属沉积的部位散射能力弱，TEM像呈现亮区基本特点：图像反差明显，富有强烈的立体感 样品被“包埋”在金属膜中，即样品表面被金属粒 子覆盖，其图像分辨率由金属粒子大小限制，样 品表面细微机构看不清，只能看到表面形貌。不能分辨杂质和病毒，造成鉴定上的困难，

3、故对 病毒样品的纯度要求较高,2.基本原理及特点：,真空镀膜仪：104105Torr 仪器结构 真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极（碳电 极、金属电极）；样品台。真空系统：两级泵真空系统，104105 Torr 加热电流供给系统：大电流变压器，提高40 50A电流。真空的作用：防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。防止样品受到金属氧化而引起的污染。,3.所用仪器,.具有高电子密度，和较高的电子 散射能力.在喷镀层中金属颗粒细小，分布均匀，高温下不升华，经久耐用.在电子束作用下，金属不会粒状化.化学稳定，不与样品反应.熔点低，易于蒸发,4.选用金属的标准,5.常用的金属：Pt，Pd，Pt-Pd,

4、Au,颗粒细10 用于很小或很薄的生物材料，如病毒、核酸、蛋白质分子等。Cu，Cr（铬的合金），颗粒粗20，用于对分辨率要求不高的较大样品，如细菌等,1、一次投影 A、样品的准备：制备样品悬液滴样品液摆载网 放入真空镀膜仪 B、金属的选取：蒸发材料有粒状、块状、细丝状、薄片状 高分辨率的样品：粒度较细的Pt，Pt-C，Pt-Pd合金 一般的样品：粒度粗、易蒸发，低价的 Cu，Al，Cr,（三）、方法：,C、投影角度的调整 调整原则：样品越细小，如核酸59，细菌30 病毒、噬菌体1215 注意：样品与蒸发源的直线距离10cm D、金属投影 先喷3s4min,厚1020nm 再 90 垂直喷碳，加

5、固,E、样品颗粒大小的测量,h:颗粒高度:投影角度 l:照片上投影长度 M:放大倍数 H:蒸发源的高度 L:蒸发源与样品的水平距离,2、二次投影 一次投影之后，将样品旋转180，再次投影,3、旋转投影:金属蒸发时,样品3060转/min 适于：极小颗粒 金属投影的电镜图像样品的颗粒呈 黑色，投影区呈白色,金属投影与日光投影的比较,唯一一种能用TEM观察样品表面方法1、适用范围:金属材料,矿物质、化合物表面 坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、孢子、花粉、木材2、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料表面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就是样品表面结构的一个“模子”，称之为复型（Replicatio

6、n)。,二、复型技术,（一）、技术概述,3、优点：分辨率极高，研究样品表面精 细结构；制样简单，不损伤样品，图像 具有立体感，在TEM下可以观察样品天然表 面或人工断面的细微结构特征。,1、一级复型（负复型）基本描述：先用有机材料直接在样品表面 印制复型，再将复型膜剥离样 品，金属投影来增加反差。常用介质：0.51%火棉胶醋酸戊酯溶液 或0.5%formvar氯仿溶液 基本步骤：滴加福尔莫瓦溶液成膜漂膜 洗膜捞膜金属投影和喷碳 加固观察 基本特点：分辨率高，2050，人工假象少；复型膜软，剥离时易变形，且不易 与样品分离,（二）、制样方法,2、预投影一级复型 基本描述：直接在样品表面进行金属投

7、影 和喷碳，制成碳复型膜，再化 学法溶解掉样品，将复型膜打 捞在载网上。典型方法：石蜡铬预投影一级复型法 基本步骤：准备材料喷铬喷碳 石蜡补强溶木材脱蜡,基本描述：用较厚的有机材料在样品表面印制一 级复型，剥离后以此为模板，进行金 属投影和喷碳，制成二级碳复型，最 后溶去一级有机复型膜，留下二级碳 复型膜。常用方法：AC纸-C二级复型法基本步骤：贴AC纸样表结构铸印于AC纸 揭下AC纸（一级复型）用石蜡将AC纸粘于玻板 金属投影与喷碳（二级复型）溶掉AC纸水浴脱蜡清洗捞膜,3、二级复型（正复型）,4、拟复型法和微粒复型法,基本描述：用于研究微颗粒材料，将其制成悬浮液，喷到云母片上，干燥后金属投

8、影，喷碳加固,云母片斜插入10丙酮溶液，漂浮碳膜，捞膜后电镜观察，此法为拟复型法。若将膜片转移到溶剂中溶解掉样品，得到该微粒的表面复型膜，即为微粒复型法。,病毒荚膜：负染色,病毒荚膜：旋转投影,病毒荚膜：金属投影,(一)、冰冻制样技术的分类 冷冻干燥、冷冻取代、冰冻超薄切片 冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等(二)、特点：1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态 2、避免了化学药剂对样品产生的影响，减 少了样品超微结构和成分的损伤，有利 于保护生物大分子活性，用于组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、尤其Xray微区分析 3、操作步骤少，时间短，适于快速研究 与诊断,三、电镜冷冻制样

9、技术概述,1、概念：由样品中游离态水分冻结形成冰晶而造 成的一种生物样品精细结构的损伤。2、结冰过程：090：六角型晶体 90140：立方体 低于140：玻璃态无定形结构（非晶态）,（三）、应用范围：形态学、组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、尤其Xray微区分析领域；其它材料的研究：塑料、橡胶、及高分子材料,（四）、冰晶损伤：,3、结冰过程与结冰速率 生物样品结冰过程：细胞外结冰：结冰温度较高、速率低 细胞内结冰：结冰温度较低、速率高 实验结果表明：冷冻速率低时,冷度温度较高，胞间形成较 大冰晶，损伤细胞结构 冷冻速率很高时,冷度温度很低，胞内外同 时形成玻璃态冰，无损伤 结论:防

10、止冰晶形成的关键:提高冷却速率（103 104/s）、降低冷冻温度,4、冷冻剂（冷媒）常用：液氮、液态丙烷、氟里昂、液氦，液态乙烷,冷冻速率冰晶直径冷冻损伤,5、冷冻保护剂 目的：防止冰晶损伤 原理：保护剂与水分结合，减少样品中 的水分，从而降低样品的冰冻点 常用的保护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO）、蔗糖、乙二醇,6、产生冰晶损伤的原因及排除方法原因：冷却速率不足；样品块过大排除方法：选择优质冷冻剂 使用最佳冷冻装置 剁碎样品 冷冻前用冷冻保护剂处理样品,第二节 冷冻断裂(蚀刻)和复型技术,一 技术概况,二 基本原理,三 样品的制备,1.优点：.避免化学试剂对样品的损伤，保持细胞 原有结构。

11、.适于观察和研究细胞膜结构，立体感 强，分辨率高.复型膜耐电子束的轰击，可长期保存,是研究生物膜的常规技术,一、技术概况,（）技术的特点,2.缺点：.冷冻会造成样品人为损伤，冰 晶损伤.获取生物膜以外的结构信息不足,（二）应用：主要用于研究生物膜的分子结构，以及观察人及各种动物、植物、微生物细胞的膜结构及细胞器的超微结构。,(一)分子生物膜结构的特性 1.生物膜的主要化学成分：脂类（磷脂，胆固醇）2.脂类分子的结构特点：亲水的头部和疏水的尾部 3.脂类分子在水中三种排列：小球分子团，脂双分子，层脂质体,二、基本原理,(二)断裂的原理 断裂总是沿着阻力最小平面进行的 即断裂总是从脂双分子层的疏水

12、区 裂开(三)蚀刻作用：冷冻蚀刻：样品断裂后，调控温度使之回升,断裂面上冻结的冰直接升华为水而挥发，从而暴露出更深一层结构的一种物理效应。,1.蚀刻条件：温度：100110 真空：1105Torr 蚀刻速度：2nm/s 时间：1590s2.蚀刻速度的规则：温度T 蚀刻 真空度蚀刻,(四)复型原理：（22.5nm)1、一般方法：先45喷Pt/C 25nm 后90 喷C 715nm(加固)2、复型的环境条件 真空优于5105Torr 温度：100 3、间歇喷碳法：喷1s,间歇34s,再喷1s,反 复45次，以防止热辐射损伤,(五)冷冻断裂仪简介 1.专用冷冻断裂及复型装置 EIKO：FD-2A、F

13、D-3 2.附件型装置：真空喷镀仪冷冻断裂装置温 度控制器,三、冷冻断裂(蚀刻)和复型样品的制备(一)技术准备：1.电极的准备,2.样品冷冻前的预处理 取材：活体取下样品1mm3 预固定:1%-2%戊二醛固定液固定13小时（戊二醛固定液的温度为生理温度，彻底固定后，冷却到4保存13h，在没彻底固定之前保存在4下会引起膜脂质从细胞膜中分离出来而造成人工假象。）漂洗：室温下PBS漂洗3次，10min次 冷冻保护：2030甘油等溶液渗透 824h,(二）操作步骤 1.冷冻 将预处理后的样品装在冷冻蚀刻装置的样品 夹中，直接冷冻或间接冷冻。2.真空中断裂 51051105托，100110 3.稍加热、

14、蚀刻 样品温度从110上升至100，保持 1590s,4.喷镀覆型 45投影喷铂，厚25nm，垂直喷碳 加固，1020nm 5.复型膜和组织的分离：腐蚀剂：动物：1030NaClO 植物：铬酸 6.清洗、打捞、干燥复型膜,(三)、冷冻断裂复型膜的命名(Branton,1975)1.两个半膜:E半膜（外半膜）：连接细胞外空间及 细胞内空间(包括内质网腔、核周间隙、线粒体内等)的半膜 P半膜（胞质半膜）：连接细胞质、核 质、线粒体和叶绿体基质的半膜 2.四个面：P半膜上的亲水面PS面（protoplasmic Surface)P半膜上的疏水面PF面（protoplasmic fracture fa

15、ce)ES(extracellular),EF,第三节 冷冻超薄切片,一 技术概况,二 冷切的基本流程,三 冷切的总结,1.冷冻超切：将样品迅速冷冻,用冷冻超薄切片机进 行切片.2.应用范围:在分子水平研究新鲜组织的超微结构,生物大分子和某些元素的分布组织化 学、免疫电镜标记,X-ray微区分析等。3.关键：防止冰晶损伤 游离态的水玻璃态的冰,一、技术概况,4.冷切适合的材料：,非生物材料：橡胶、胶片、塑料、纸张、纺织品高分子材料,生物材料：组织块、细胞团、病毒、生物大分子、微生物,5.冷冻超薄切片的难点：,防止冰晶损伤,排除干燥损伤,、省去经典的超切固定、脱水等过程，实现快速固定，适于快速制

16、片、适于快速研究与诊断。、切片前后避免了化学药剂的处理，样品结构、成分不发生变化，尤其可溶性成分不被抽提，保持了细胞或组织的原始生活状态，使电镜图像更具有接近生物的存活状态。、能很好保存生物大分子活性，有利于组织化学、免疫电镜技术、酶活性、电镜放射自显影、Xray微区分析等领域中对细胞化学和细胞成分进行定量定性分析。,6.冷冻超薄切片的优点：,7.所用仪器：冷冻超薄切片机、仪器准备：专用的冷冻超薄切片：FC-4E,FC-4D 配有附件的普通超切机 如：Sweden LKB Cryo NoVa,LKB2088、FC 4E性能：a.5min内完成制冷，最低t=-190 b.灵活调节刀、样品的温度

17、c.液氮消耗低、自动充盈，连续3h d.切片小室内不结霜，利于操作,8.冷切制备程序的分类,无溶液制备法：步骤：取材快速冷冻 切片干燥 染色或不染色镜检；特点：有利于保存生物材料中的可溶性物 质及生物大分子的活性和天然构型。应用：可溶性物质的放射自显影、X射线微区分析。,固定样品制备法：步骤：取材醛类固定样品包封（夹埋）冷冻保护处理切片染色镜检特点：该方法用醛类固定及冷冻保护处理，较好保存细胞的精细结构，应用：适用进行形态学、细胞化学、免疫化 学的研究。,二、冷切的基本流程,（一）、取材 原则:快、准、鲜 大小:边长0.51mm的块,（二）、醛类固定,典型方法：0.1M的二甲砷酸钠缓冲(pH=

18、7.2)的2.5%戊二醛固定液或4甲醛0.5%戊二醛混合固定液固定1h,04,注意：研究的目的和材料不同，固定液的浓度和处理时间可以不同。一般的形态学研究：2.5%戊二醛固定1560min,4做免疫电镜标记时：0.21%戊二醛固定515min,4,（三）、预包埋(包封、夹埋),包封：采用某些大分子量的支持介质，将组织块包埋起来，以便于切出大面积平整的切片。,具体操作：将组织块放入1020 的明胶溶液中，1530min,冰箱冷却到4，凝固，样品被明胶包封。,(四)、冷冻保护处理 1.常用试剂：2060%甘油水溶液 2050%DMSO,5%聚乙烯醇 1.62.3mol/L蔗糖溶液 2.处理时间：5

19、min3h 3.浓度原则：组织含水量，保护剂浓度,(五）、冷冻固定 1.液氮直接冷冻：12S，达196 液氦273 2.间接冷冻固定（中间冷媒法）,（液态丙烷）,3.金属接触法：铜块液氮中铜块接触样样预冷 样入液N4.双丙烷喷气式冷冻法 双丙烷喷气式冷冻机RMCMF72005.高压冷冻法高压冷冻机LeicaReichert 样品夹放入高压腔中，注入液氮，加压冷冻。高压下2100标大气压下，水的凝聚点降到22，形成冰晶和冰晶生长的速度降低，为组织深层冷冻提供了时间。可以冷冻直径为1mm左右的样品，如真菌芽孢。,(六)、切片和捞片 1.切片时温度的控制与选择 选择切片时样品的温度 生物样品T-35

20、,冰晶损伤小 细胞内小分子物质和小元素固定下 来,T-80 形成玻璃无定形水溶液混合相,始 终T-140,（若T-140 则样品中无 定形固体化的水份发生变形，而且变形不可 逆。）,刀温比样品温度高1020根据研究的目的选择样品的温度,2.切片的速度和厚度 样品温度-60-80 切速：0.5mm/s 厚度：70100nm3.刀的选择:(玻璃刀，钻石刀)注意：(1)切片之前冷却刀(2)钻石刀反复使用后需要调整(3)玻璃刀口上喷钨，增加其锋利性(4)钻石刀使用后需认真清洗，防止腐蚀(5)使用玻刀时，用铝铂胶条做水槽，冷的 硅胶密封,4.修块 切片机修块法 预修块法5.切片:(关键：稳定温度）湿刀法

21、：低温下，DMSO做槽液 干刀法：无槽液，刀角5070,6、捞片(切片收集)：A 干刀法切片的收集(1)液滴法：玻棒粘液粘切片在 铜网上展片洗去糖液(2)直接拨取法：拨片到冷铜网上 镜面压平（此过程维持样品低 温，在超切机的冷冻样品室进行）B 湿刀法切片的收集(1)用预冷的有膜铜网捞片(2)塑料环套法：,（七）、冷冻干燥 优点：消除表面张力，避免有机溶 剂对细胞质的抽提 缺点：低温(-80）真空需几天或几十小时（八）、染色 冷切多用负染色 0.2%-1%磷钨酸，pH6.5-8.5,染色115s 0.5%-3%醋酸双氧铀，pH4.5-5.2,染色115s 负染色：方法简单，分辨率高、染色时间短，

22、有利于保存结构 正染色：适于免疫电镜、细胞化学（九）、观察,三、冷切总结：取材（醛类固定预包封）冷冻 保护冷冻固定冷冻超切 直接冷冻观察 冷冻干燥染色常温观察 低温X-ray微区分析 免疫细胞学,第四节 冷冻其他相关技术,1.冷冻干燥 避免化学试剂的固定和脱水 将冰或固体脱水剂直接升华为气体2.冷冻取代(1)低温下，用有机溶剂取代生物 中的冰，速度相当缓慢(2)升华固态的有机溶剂,第五节 冻安全规则,四防：防冻伤 防窒息 防爆炸 防燃烧,作业,1.名词：冷冻蚀刻、冰晶损伤、冷冻保护、金属投影技术、复型技术2.常用的金属投影方法、复型的方法有哪些？3.冷冻制样中为什么产生冰晶损伤?怎样排除？（冰晶损伤的原因，如何防止冰晶损伤？)4.简述冷切制备过程，与普切比较，其优 点是什么？简述冷冻超切的一般操作步骤。5.为什么对样品进行冷冻保护？常用的冷冻保护剂及保护方法？6.什么是冷冻断裂复型技术？它的主要步 骤及优缺点是什么？7.细胞冷冻断裂产生哪些膜面？如何命名？8.冷冻安全规则是什么？,大鼠肝细胞冷冻蚀刻照片,分离的人沙眼支原体,小鼠肝细胞冰冻蚀刻照片,洋葱的根细胞,人肺II型板层体冷冻蚀刻照片,冷杉木材管胞纹孔及微纤丝,