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1、病毒载体研究进展,基因载体系统,病毒载体系统,非病毒载体系统,腺病毒载体,反转录病毒载体,腺伴随病毒载体,单纯疱疹病毒载体,慢病毒载体,裸DNA,DNA-阳离子脂质复合物,DNA-蛋白质复合物,细胞内包装,细胞外包装,DNA-阳离子多聚物,DNA/RNA嵌合物,吴小兵（863计划生物领域病毒基因载体研发基地）,病毒载体概述（1）,要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病,容量：自身基因组大小的105%110%,组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜,用途：基因转移和表达 1、基因治疗 2、疫苗
2、 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究,病毒载体概述（2）,优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；2、复杂的装配过程由细胞完成；3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。,常用的病毒载体的特点：,病毒载体研究方向,1、病毒包装系统,2、无病毒基因的病毒载体,6、自我扩增型病毒载体,7、条件增殖型病毒载体,5、嵌合型病毒载体,3、靶向性病毒载体,4、可调控表达的病毒载体,8、新病毒载体,病毒载体包装系统,组成：1、宿主细胞 2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）3、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件,单因素生产系统（one-component system),
3、双因素生产系统(two-component system),gag pol env,图1 反转录病毒包装系统示意图,图2 腺病毒包装系统示意图,293 cell,E1a,b,JM17,Ad Shuttle,293 cell,E1a,b,多因素生产系统(multi-component system),图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图,Host cell+vector DNA,Helper virus+helper plasmid,图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图,proviral cell,Recombinant helper virus(rHSV-repcap),无病毒基因的病毒载体
4、,被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。,腺伴随病毒载体：,反转录病毒载体：,腺病毒载体：,单纯疱疹病毒载体：,gene,ITR,ITR,pA,无辅助病毒包装系统,图5 重组AAV无辅毒包装系统,Adenovirus with packaging signal flanked by loxP,图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统,靶向性病毒载体,转导靶向性,转录靶向性（特异性）,改造病毒外壳/外膜,连接靶向性结合分子,Modified adenovirus,cel
5、l,组织特异性启动子,肿瘤选择性启动子,细胞周期调控启动子,肿瘤血管内皮导向启动子,双特异性启动子,病毒增殖的特异性转录调控,可调控表达的病毒载体,细胞的调控元件,病毒的调控元件,人工合成的调控元件,细胞特异性转录,细胞启动子 病毒启动子albumin MVM P4Tyrosinase or TRP-1 B19 promoterPSA HBVMBP JCV MCK EBVGFAP NSE KDR/flt-1AFPCEAerbB2HREMDR1,四环素调控,合成的转录因子,FKB12,ZFHD-1,FRAP,P65,rapamycin,RU486,Diphenol indene,murister
6、one,重组病毒的生产和纯化,小量制备和纯化,大量制备和纯化,场所细胞培养细胞裂解病毒分离病毒纯化制剂保存,培养瓶 转瓶、细胞工厂、发酵罐,反复冻融 机械法或化学法裂解,实验室 中试车间,离心 离心、超滤、萃取,密度梯度超速离心 浓缩、柱层析,配方,缓冲液,低温,病毒载体与基因治疗产业化,基因治疗产品的知识产权构成 1、治疗基因2、调控元件3、改造的外壳/外膜4、靶向分子5、包装系统6、生产和纯化技术7、制剂和保存技术,产业化的组织和实施：1、合作开发2、专业分工3、政府支持和企业投资4、利益分配,基因治疗的三个核心部分 1、基因载体系统2、基因表达系统3、治疗基因,知识产权和基础研究,专利对学术研究的影响1、无影响（对非常早期研究）2、有影响（对临床试验和可能的商业开发）,基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护,对于基因治疗公司最重要的专利是：1、载体系统；2、生产过程；3、整体治疗方案 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。,政府支持对基因治疗产业化的重要作用1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发2、资助基因治疗核心技术研究和开发3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品5、促进新的基因治疗公司建立。6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。,
