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1、1.限制酶的选择原则,（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。,（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类,所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以
2、所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst 因其会破坏标记基因而不宜选择。所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。,所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hind会破坏启动子，EcoR会破坏终止子，而Nde和BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。（3）参考Ti质粒的TDNA片段选择限制酶若质粒上标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到TDNA
3、片段上因为Ti质粒的TDNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba 和Sac（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）,2.目的基因的检测与鉴定（1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受
4、体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：,“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。,（2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。（3）采用“抗原抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原
5、）与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。（4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。,【例证】（2016全国卷，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的）。,根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是_。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（
6、c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有，不能表达的原因是_。,图（c）（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。,慧眼识图获取信息（1）三种限制酶切割结果分析,（2）表达载体与重组DNA分子分析,答案（1）Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（3）EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶,1.（2019湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流
7、程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst、EcoR 和Hind 的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：,（1）过程所用到的组织细胞是，过程所用的酶是。过程常用溶液处理大肠杆菌。（2）经过程得到的互补DNA片段，称为。（3）如果用限制酶Pst、EcoR 和Hind 对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类（填“相同”或“不同”），这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有种
8、和种。,（4）如果只用限制酶Pst 切割目的基因和质粒，完成过程、后（受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_。,（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的_步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是_。,解析（1）过程获得的是人
9、生长激素mRNA，所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过程构建基因表达载体的酶是DNA连接酶；过程将基因表达载体导入大肠杆菌前，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。（2）过程是人的生长素mRNA逆转录形成cDNA的过程。,（3）Pst、EcoR 和Hind 三种酶的切点分别用1、2、3表示，一种酶酶切时，一共可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得到12，21，23，32，13，31六种片段；三种酶酶切时，可得到12，23，31三种片段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类相同。这些种类的DNA
10、片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。,（4）在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的pBR322质粒或含有Ampr、Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长。,（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、
11、四环素培养基上的过程，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的pBR322质粒的化学本质是DNA，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。答案（1）人垂体组织细胞DNA连接酶CaCl2（2）cDNA（3）相同33（4）含四环素抗性基因完整的pBR322质粒（或含有Ampr、Tetr的质粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）筛选含目的基因的受体细胞磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基,2.（2019河南名校联盟调研）如图所示为培育转基因细菌的操作流程，回答下列问题：,（1）图中过程所用工具酶有。为了防止载体和外源DNA自连，应如何操作？_。（2）当细菌的转化过程中吸收的外源D
12、NA是病毒DNA时，该转化过程又称转染。图中外源DNA来自。为了提高转染效率，应使用处理细菌。（3）图中过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？_。,（4）图中过程，筛选含重组质粒的细菌需用到基因的功能。已知所用载体内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素的培养基上生长，但不能在含青霉素的培养基上生长的细菌即为含外源DNA细菌的前提条件：_（答出两点即可）。解析根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源DNA应来自（DNA）病毒。另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。,答案（1）限制酶和DNA连接酶应使用两种限制酶同时切割载体和外源DNA（2）（DNA）病毒Ca2（3）模板、原料、酶和能量等（4）标记原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源DNA插入到载体的青霉素抗性基因内部,
