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1、2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,实验一 蛋白质的性质实验,王 伟 中国海洋大学医药学院,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,实验目的,1.加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知识2.掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分析的方法及原理,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,实验原理,一、蛋白质呈色反应二、蛋白质沉淀反应,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,一、蛋白质呈色反应,蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生成有色物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全
2、一样。呈色反应并不是蛋白质的专一反应。因此，不能仅仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断被测物质一定是蛋白质，至少要用2种以上的方法来鉴别。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,蛋白质呈色反应,（一）米伦氏反应（二）双缩脲反应（三）蛋白黄反应（四）茚三酮反应,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,（一）米伦氏反应,蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反应，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反应。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,（二）双缩脲反应,当尿素经加热至180左右时，两分子尿
3、素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，此类似反应也称蛋白质的双缩脲反应。凡分子中含有两个以上肽键的化合物都呈此反应，故所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,反应过程如下：,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,（三）蛋白黄反应,在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为桔黄色的硝醌衍生物;此蛋白黄反应（以苯酚为例）为:,2009.10-12
4、,医药学院生物化学实验课件,（四）茚三酮反应,在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物),含有氨基的其他化合物亦可能发生此反应。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,反应第一步:,还原茚三酮,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,反应第二步:,蓝紫色缩合物,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,二、蛋白质沉淀反应,蛋白质是亲水胶体，正常状态下，蛋白质分子表面具有水化膜和双电层，能保持其胶体溶液的稳定性，在一定因素的影响下，蛋白质会失去电荷和脱水沉淀。蛋白
5、质的变性与沉淀之间没有必然联系,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,蛋白质沉淀反应,（一）蛋白质的盐析作用（二）乙醇沉淀蛋白质（三）重金属盐类沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀蛋白质,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,（一）蛋白质的盐析作用,加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实验时要加足够量的盐蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解,2009.10-12,医
6、药学院生物化学实验课件,（二）乙醇沉淀蛋白质,有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,（三）重金属盐类沉淀蛋白质,溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。此时的
7、溶解为生成憎水胶体的缘故。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质,生物碱是植物中具有显著生理作用的类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异。因此被用于蛋白质的首选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物，加热可除去。,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,实验材料,一、实验材料：鸡卵清蛋白液，吸管（1mlx4，2mlx
8、4，0.5mlx1，5mlx2），试管（1.5x15cmx14），水浴锅，滴管，电炉二、实验试剂：苯酚（0.5%），米伦试剂，茚三酮（0.1%），尿素，NaOH（10%），硫酸铜（1%），硫酸铵固体，95%乙醇，NaCl，醋酸铅，鞣酸，苦味酸，冰醋酸,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,实验操作,颜色反应沉淀反应,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,颜色反应按下图操作,1、米伦氏反应：Pr+米伦试剂 白色沉淀 红色2、双缩脲反应：3、蛋白黄反应：Pr+34d浓HNO3观察，再加NaOH，再观察4、茚三酮反应：Pr+茚三酮（0.5ml）（沸水浴）观察颜色变化,加热,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,沉淀反应按下图操作,1、盐析：Pr+(NH4)2SO4 粉末 沉淀 观察 2、乙醇：Pr+95%乙醇 沉淀 3、重金属离子：Pr+醋酸铅或硫酸铜 沉淀 4、生物碱试剂：Pr+鞣酸或苦味酸 沉淀,加水,2009.10-12,医药学院生物化学实验课件,实验注意事项,(1).在操作过程中试管不能冲向他人以防止烫伤。(2).操作强酸时要注意，吸管使用要规范。(3).双缩脲反应铜离子不能多加，否则与氢氧化钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。(4).实验报告各部分内容都要包括，实验结果如实记录，并写出结果讨论，分析实验的成败原因，加深理解。,
