过程分子生物学.ppt

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1、过程分子生物学,5,2,3,4,1,6,基因的表达与调控,细胞通讯的分子机制,免疫多样性的分子识别,胚胎发育的基因表达谱,肿瘤发生的分子机制,基因组学与系统生物学,肿瘤发生的分子机制,恶性肿瘤或癌症是严重威胁人类健康的大敌，其死亡率仅次于心血管疾病而名列第二。虽然癌症困扰人类几千年了，但一直到1911年，人们对癌症的认识才刚刚起步。这一年Peyton Rous发现，鸡肿瘤组织的无细胞过滤物能使健康的鸡长出新的肿瘤。然而又过了很久人们才知道，Rous当年发现的那种过滤性无细胞组分实际上是一种肿瘤病毒。上世纪80年代初，随着分子生物学进入第二阶段，癌症发生分子机制的研究取得了重大突破。虽然迄今为止

2、我们对癌症的分子机制仍缺乏一个全景式的概念，但至少人们可以将几百万字有关癌症的学术专著一气哈成，每年的癌症国际学术会仪也有几十次。各种癌症疗法已普遍在临床上给生命重危的患者带来生存的希望，尽管他们中90%的人在不久还是离开了人间。本讲重点论述癌症形成的分子机制，目的是帮助我们理解抗癌,药物的设计与应用。,肿瘤发生的分子机制,E,B,C,D,A,F,癌细胞及癌症的基本特征,病毒致癌的分子机制,原癌基因的生物学功能,原癌基因活化的分子机制,抑癌基因的作用原理,端粒酶与肿瘤形成的关系,5A 癌细胞及癌症的基本特征,锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂,a 癌细胞的三大基本生物学特征

3、,正常哺乳动物细胞的四大生物学特征,血清依赖性：细胞必须在生长因子的存在下才能生长,接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制,形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构,这些特征使得正常的脊椎动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代，且细胞在培养皿上以平面形式生长，即单层细胞生长。正常细胞有时会改变某些特征而越过某生理临界点继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，但处于细胞系中的细胞与癌细胞不同，它的生长仍受控制，而且仍具有正常细胞的四大特征。,癌细胞的三大生物学特征,永生性：无终止地生长，涉及到生长控制机制的改变,转化性：无限制地生长，脱离了生长因子的调控,转移性：细胞获得入侵正

4、常组织的能力，使得癌细胞远离起源,的组织，在机体其它区域形成新的细胞克隆，对癌症,90%的死亡案例负有责任。（Science，331，2011）,5A 癌细胞及癌症的基本特征,b 癌细胞的形成,癌细胞是由正常细胞转化而来的，这个过程称为细胞的转化，其中癌细胞就是转化细胞。正常细胞的转化由环境因素和遗传因素所触发，这些因素触发的形式是细胞内分子水平上的改变，因此癌症本质上是一种分子病。一般地，转化细胞的发生是多种因素综合的结果，大约需要6-7个因素、耗时20-40年才能诱导癌症的产生。许多化学、物理、生物试剂是正常细胞转变成转化细胞的外部条件，这类物质称为致癌剂，它们可分成两大类：启动剂和促进剂

5、，分别作用于癌细胞形成的不同阶段,癌症发生的遗传因素,然而在某些情况下，癌症的发生是遗传的，这表明单一的遗传变化已足以致癌，但更多的则是多重遗传变化的共同结果。在这些遗传变化中，有的是触发或启动癌的形成，有的则仅仅是帮助癌的形成。,5A 癌细胞及癌症的基本特征,c 癌基因与抑癌基因,现在已经知道人体内存在着两大类基因，它们的突变能导致癌的形成，这两大类基因是：,癌基因（Oncogenes）,Oncogenes最初是从病毒基因组中发现的，能使病毒感染的靶细胞致癌。后来发现绝大多数的病毒癌基因都有其对应的细胞伙伴，这些与病毒癌基因相对应的细胞中的伙伴基因称为原癌基因（Proto-oncogenes

6、），它们在细胞中具有正常的生物学功能。然而在某些情况下，这些原癌基因的突变或异常激活与癌的形成有关。目前大约有,350多个原癌基因或癌基因被克隆鉴定。,抑癌基因（Tumor suppressors）,目前大约有近30多种抑癌基因被鉴定。抑癌基因的突变或缺失也是致癌的一种因素，而且往往是最重要的因素。总之，癌症发生的分子本质是基因的突变，而癌症发生的条件是,环境和遗传两大因素。,5B 病毒致癌的分子机制,a 肿瘤病毒的转化特性,能导致宿主动物产生肿瘤的病毒称为肿瘤病毒。正常细胞转化的发生可以是自发的，可以由某些化学物质或物理射线所诱导，也可以由肿瘤病毒的感染引起，而后者的可能性最为显著。,肿瘤病

7、毒的性质,肿瘤病毒的种类繁多，但不外乎两大类：DNA病毒和RNA病毒（逆转录病毒），它们广泛存在于动物体内。一种细胞对病毒感染的敏感性取决于它的种属及性状。根据病毒感染后宿主细胞的命运，可将其分为两大类：,裂解型细胞：病毒感染后经过裂解循环，产生并释放出大量的成熟病毒颗粒，最终导致宿主细胞裂解死亡；转化型细胞：病毒感染后不在细胞内复制后代，但能整合在宿主细胞的基因组上，一部分整合了病毒基因组的细胞发生转化，其性状及生长特征发生改变，遂形成癌细胞。,肿瘤病毒使细胞发生转化的机制,那么是什么东西促使肿瘤病毒转化其靶宿主细胞的呢？肿瘤病毒本身并不携带一整套诱导宿主细胞性状发生巨大变化的基因，它们只是

8、启动与细胞转化有关的一系列事件的发生，而这些事件的发生需要细胞内的蛋白质来实现。从某种意义上来说，肿瘤病毒只是扳动了改变靶细胞生长特性的调控开关。肿瘤病毒的转化活性来源于病毒基因组中的某些特殊基因，这些特殊基因就是oncogenes癌,基因。,5B 病毒致癌的分子机制,b DNA肿瘤病毒,乳头瘤病毒的基因组为大约 8kb 的双链DNA。这个家族包括大约60种人的乳头瘤病毒成员（HPVs），其中绝大部分病毒与息肉的初期生长有关，但有些病毒成员能致癌，尤其是宫颈癌，临床上几乎所有的宫颈癌患者均伴有HPV感染。与宫颈癌发生有关的病毒产物是E6和E7,乳头瘤病毒（Papillomaviruses）,蛋

9、白质，它们使靶细胞产生癌细胞的永生性。,多瘤病毒（Polyoma Viruses）,多瘤病毒家族各成员的基因组为5-6kb的双链DNA，普遍存在于大鼠体内。多瘤病毒家族的成员之一SV40（Simian Virus 40）是从弥猴细胞内分离到的。最近，人体中的多瘤病毒同族成员BK病毒和JC病毒也已被鉴定。,所有的多瘤病毒同族成员，如果将之注射到新生的啮齿目动物体内，均可导致肿瘤的发生。被多瘤病毒转化的细胞基因组中含有病毒的全部或部分基因的整合拷贝，而且这些整合顺序中总是包含病毒基因组的早期区域。,这种早期区域后来被鉴定为T抗原编码基因。细胞转化的特性就是T抗原在细胞内作用的结果。T抗原的转化活性

10、依赖于它与细胞蛋白质的相互作用的能力，这种相互作用刺激了处于静止期的细胞进入分裂阶段，导致细胞无限制生长而形成肿瘤，其名字由此而来（T：tumor）。,在裂解型宿主细胞中，T抗原是直接与病毒基因组作用的，其结果是导致病毒DNA的复制，它使宿主细胞裂解，但不致癌。,腺病毒（Adenoviruses）,腺病毒家族的基因组为37kb的双链DNA。该病毒最初是从人的腺体组织中分离出来的，相似的病毒也已从其它哺乳类动物体内分离到，它含有80多个成员，是个较大的病毒家族。人的腺病毒与呼吸道疾病有关。人体细胞对腺病毒而言是裂解型的，不会致癌，但对啮齿目的动物细胞来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌，其致癌的基

11、因是病毒基因组中的EA1和E1B两个基因。,EA1和E1B基因编码的是核蛋白，参与基因的表达调控。E1A蛋白并不直接与DNA结合，而是调控RNA的多样性剪切过程（在病毒中）。E1A基因本身也是通过RNA多样性剪切表达出三种大小不等的蛋白质，这三种蛋白质都是磷酸化的。在靶细胞核内，它们与靶细胞的转录因子结合，或阻止转录，或诱导DNA合成，从而导致肿瘤发生。,埃波斯坦病毒（Epstein-Barr Viruses）,埃波斯坦病毒的基因组为大约160kb的双链DNA。它是一种人的疱疹病毒，能引起许多疾病，如感染性单核细胞增多症、鼻咽癌、淋巴瘤等。EBV宿主范围窄，体外实验表明这种病毒可导致B淋巴细胞

12、癌。其致癌的基因是BNLF-1，编码一种膜蛋白，致癌机制不详。,DNA肿瘤病毒的基本特征是：其致癌能力由一个或多个基因编码，前三种病毒的致癌基因均是病毒早期基因，只有EBV中的BNLF-1是晚期基因。这些致癌基因在病毒早期的裂解循环中参与病毒颗粒的复制；当转化发生时，它们整合进入转化细胞的基因组中，持续表达致癌蛋白（Onco-protein），并由其致癌。由此可见整合是病毒致癌的必要条件。,5B 病毒致癌的分子机制,c RNA肿瘤病毒,RNA肿瘤病毒属于逆转录病毒（Retroviruses）,逆转录病毒均为RNA单链病毒，其基因组为6-9kb的单链RNA，它们感染宿主细胞有两种方式：横向感染与

13、纵向感染。,逆转录病毒的感染特征 横向感染,逆转录病毒感染宿主细胞后，单链RNA在其编码的逆转录酶的作用下，先逆转录成单链DNA，然后转变成双链DNA。双链DNA最终整合入宿主细胞基因组上，在那里再转录成有感染力的单链RNA。这一单链RNA作为mRNA转译出病毒包衣蛋白，并将两分子的单链RNA包装成成熟的逆转录病毒颗粒，经宿主细胞释放后再去感染其他的宿主细胞。,逆转录病毒的感染特征 纵向感染,病毒双链DNA直接整合入宿主性细胞基因组内，从而以遗传单位的形式成为宿主的内源性病毒，并垂直遗传给宿主的子代。,由此可见，不管是横向感染还是纵向感染，整合是逆转录病毒生命周期中的必经之路。,逆转录病毒基因

14、组整合的后果,逆转录病毒基因组整合入宿主细胞基因组的形式有两种：,病毒基因组以转座子转座的机理随机整合到宿主细胞基因组的任何位点上,病毒基因组插入宿主细胞基因组后，与其转录出来的RNA发生RNA重组（非同源重组），并借此捕获宿主基因组片段,宿主细胞被逆转录病毒感染后的命运,上述两种整合事件均有可能导致下列三种宿主细胞被感染后的命运：,病毒基因组的整合未给宿主细胞带来任何表型上的异常，病毒潜伏在宿主细胞内,病毒基因组的整合导致宿主细胞产生病变，甚至导致细胞死亡,病毒基因组的整合导致宿主细胞转化为癌细胞,上述三种命运的发生取决于病毒的性质，也取决于宿主细胞的性质，同时由于时间差异，三种命运尤其是前

15、两种命运会相互转化。能导致癌的逆转录病毒称为RNA肿瘤病毒。,肿瘤逆转录病毒的致癌特征,肿瘤逆转录病毒根据其致癌能力的起源可分为两大类：,非缺陷性病毒：它们与非肿瘤逆转录病毒的基因结构一样，一般情况下进行正常的病毒复制循环，对宿主细胞不致癌。在特定的情况下，基因组发生突变，导致病毒整合位点附近的宿主细胞基因组发生改变，从而形成致癌能力。也就是说，这类病毒的致癌性并不依赖于病毒本身的癌基因，而是依赖于病毒激活宿主细胞癌基因的能力。,急性转化病毒：它们拥有致癌基因，能在宿主细胞能迅速诱导肿瘤形成。但是应特别注意的是，这类病毒所携带的癌基因也不是病毒本身固有的，而是病毒在感染周期的整合阶段中从宿主细

16、胞基因组中捕获的。,总之，肿瘤逆转录病毒致癌的本质是宿主细胞自身的癌基因。,5B 病毒致癌的分子机制,d 宿主细胞癌基因的捕获与激活机制,肿瘤逆转录病毒起先并无癌基因，它们的癌基因是从宿主细胞基因组中捕获的。原癌基因在细胞内原先也不致癌，但被肿瘤逆转录病毒捕获后，得以修饰成致癌性。为了区分两者，病毒癌基因在基因名称前冠以“v”；而细胞原癌基因则冠以“c”。如Rous肉瘤病毒中的癌基因src为v-src，它对应的细胞原癌基因则为c-src。有时，不同的肿瘤逆转录病毒含有同一种v-onc；而有些病毒的v-onc则来源于同一c-onc的不同突变体。,肿瘤逆转录病毒的癌基因与宿主细胞的原癌基因,宿主细

17、胞癌基因的捕获机理,v-onc是在逆转录病毒感染宿主细胞期间，以RNA的形式从宿主细胞中捕获的，因此逆转录病毒v-onc的顺序组织对应于相应的c-onc的mRNA而不是DNA。v-onc不含内含子，而c-onc具有典型的内含子结构。,缺失,转录,剪切,基因,hn RNA,mRNA,转录,包装,RNA异源重组,v-onc,病毒基因组,细胞原癌基因,LTR gag pol env LTR,宿主细胞原癌基因的激活机理,肿瘤逆转录病毒的v-onc为什么能致癌呢？,定量模型：v-onc与c-onc相比，只是少数几对碱基有变化，产物相同，功能也相同，但v-onc的表达失去控制，突变导致基因过量持续的表达。

18、正是由于这种过量持续的表达导致肿瘤形成，如v-mos、v-sis、v-myc等。,定性模型：v-onc的产物与c-onc的产物相比，或者N端或者C端或者两端缺失了十几个氨基酸残基，导致蛋白产物性质的改变，如蛋白质的定位或敏感性等，进而致癌。,5C 原癌基因的生物学功能,逆转录病毒基因组上携带的癌基因是宿主细胞基因组中原癌基因的变异体，其功能与原癌基因相同或相似。那么原癌基因的产物是什么？其正常的生物学功能又是什么呢？了解这些对认识癌基因的致癌机理极为有益。研究结果表明，目前已经克隆鉴定的绝大多数原癌基因，其产物（即原癌蛋白）均与细胞生长及信号转导有关，它们均是细胞生长调控途径中的功能组分。正常

19、的原癌基因产物使得细胞生长以一种即定程序进行，当原癌基因因某些机制转化为癌基因时，其产物就会不受控制地变成永久开放型，并激活细胞无止境地分裂、增殖，直到机体死亡。根据原癌基因产物的细胞学定位及生物功能的不同，可将原癌基因分为四大类：,5C 原癌基因的生物学功能,a 编码生长因子的原癌基因,这类原癌基因的典型代表是c-sis基因。该基因编码的蛋白质为血小板样生长因子（PDGF）B链，一种潜在的成纤维细胞有丝分裂原。PDGF与其受体结合后，可通过Ras通路或Ras非依赖性通路将信号传递至核内，导致相关基因的表达，最终刺激细胞的分裂与增殖。癌基因v-sis则由于基因序列的突变，其编码的多肽与正常的P

20、DGF在结构上有轻微的差异，致使这种癌蛋白与正常受体的亲和力大增，引起刺激细胞分裂的信号持续传递，细胞分裂便无限制地进行。有的癌基因v-sis则由于基因表达调控元件发生突变，导致细胞大量合成PDGF，大剂量连续地结合其受体，刺激细胞永久分裂与增殖。,5C 原癌基因的生物学功能,b 编码生长因子受体的原癌基因,这类原癌基因包括：,上述生长因子受体都是跨膜蛋白，而且在其C端（胞质区域）均有酪氨酸激酶活性。在正常情况下，生长因子受体与配体结合后，导致C端自身磷酸化，并将信号沿通路转导入细胞核中。,c-erbB（表皮生长因子受体，EGFR）c-fms（细胞集落刺激因子受体，CSF-1R）c-trk（神

21、经生长因子受体，NGFR）c-fgfr（成纤维生长因子受体，FGFR）c-pdgfr（血小板样生长因子受体，PDGFR）,EGF受体编码基因突变的致癌机制,正常EGF单体的N端具有抑制二聚体形成的功能。v-erbB是c-erbB的突变基因，它缺失了N端和C端的编码区域，产生无N端和无C端的受体癌蛋白，但保留了跨膜区及酪氨酸激酶活性。N端的缺失使癌蛋白在无配体情况下，仍能连续形成二聚体；,而C端的缺失又解除了自身磷酸化的抑制作用，最终导致表皮细胞无节制地分裂与增殖形成表皮癌。,5C 原癌基因的生物学功能,c 编码细胞内信号传递因子的原癌基因,这是原癌基因中最大的一个家族，它可分为两大亚家族：即膜

22、结合型的G蛋白基因家族及细胞质蛋白激酶基因家族，后者又包括酪氨酸型激酶基因及苏氨酸/丝氨酸型激酶基因。,编码G蛋白的原癌基因,编码G蛋白的原癌基因家族包括c-ras，c-gsp，c-gip，Tiam 等基因。Ras蛋白是一GTP/GDP结合型的单聚体，同时具有GTPase活性。Ras-GDP呈无活性状态；Ras-GTP呈活性状态，能作用于靶分子。鸟嘌呤核苷酸释放因子GNRF能促进Ras用GDP交换GTP；GTPase激活蛋白GAP则,促进GTP水解为GDP。,编码Ras癌蛋白的癌基因v-ras,癌基因v-ras编码的Ras癌蛋白对GAP不敏感，这使得Ras-GTP永远处于活化状态，连续刺激靶分

23、子，导致相当一部分基因永久性地表达，这就是癌症发生的机理之一。,编码胞质蛋白激酶的原癌基因,编码胞质蛋白激酶的原癌基因家族包括：c-src，c-abl，c-fps，c-raf、c-mos等等，其中前三者是酪氨酸激酶，后两者是丝氨酸/苏氨酸激酶。这些原癌蛋白中只有Src蛋白是膜结合型的，其它几种原癌蛋白均是胞质游离型的。现以c-src的编码产物为例：c-src和v-src两者同源性极高，都编码60kD的Src蛋白。两种蛋白的N末端都具有罕见的修饰物：一分子的肉豆蔻酸（十四碳脂肪酸）共价连在N端的Gly上。尽管Src的N末端不含许多疏水氨基酸，但接上肉豆蔻酸的N末端能顺利地锚在细胞膜的内侧,原癌蛋

24、白c-Src的结构与功能,原癌蛋白c-Src由膜结合区、模件区、催化区、控制区组成。在模件区内有两个功能域：SH2和SH3（Src-Homology）。SH2大约由100个氨基酸组成，负责与其它蛋白质中磷酸化了的Tyr位点结合。含有SH2功能域的蛋白质必须与磷酸化的Tyr位点结合后，方能被激活。激活的c-Src又靠其SH3功能域作用于下游的靶蛋白分子，从而完成信号的转导。,原癌蛋白c-Src的结构与功能,在c-Src中Tyr527是磷酸化的，这使得c-Src的C末端与本身的SH2功能域结合。当一个合适的受体酪氨酸激酶（如PDGF受体）被激活时，受体自身磷酸化，后者与c-Src的SH2功能域,结

25、合，同时释放出Tyr527，并将其磷酸基因转移至Tyr416。Tyr416磷酸化后，c-Src被激活，进而发生信号转导作用。,无活状态,激活状态,癌蛋白v-Src的结构与功能,癌蛋白v-Src本身缺失Tyr527，于是Tyr416被自磷酸化，因而不管有无配体受体，v-Src始终是活化的，因而导致细胞无节制分裂与增殖。多瘤病毒的T抗原之所以能致癌，就是因为它能特异性地与c-Src的Tyr527结合，使其不能被磷酸,化，其后便发生类似的事件。,5C 原癌基因的生物学功能,d 编码核内转录调控因子的原癌基因,这类原癌基因产物作为转录调控因子直接影响基因的表达，包括：c-jun，c-fos，c-myc

26、，c-rel，c-myb，c-erbA。,c-rel 原癌基因家族,c-rel原癌基因家族最早发现的是其所对应的癌基因v-rel，后者是在鸟类网状内皮瘤病毒中鉴定出来的癌基因。这个逆转录病毒在鸡体内高度致癌，导致B-淋巴细胞瘤。v-rel与c-rel的最大不同是其C末端缺失了大约100个氨基酸残基，并在剩余的序列中含有少量的点突变，正是这些变化导致了v-Rel蛋白的强烈致癌特性。人体内也有c-rel基因。T-淋巴细胞中至少有四种原癌基因c-rel家族的产物成员，其中研究最为详尽的是转录调控因子NF-kB。在体内，NF-kB呈二聚体p65/p50，进入核内后与含有kB结合位点的基因表达调控元件结

27、合，并启动该基因的转录。体内相当一部分基因的启动子或增强子内部含有kB结合序列，所以NF-kB和I-kB是一对主要的转录调控因子。,c-rel 原癌基因家族,癌基因v-rel的产物由于缺失了一个区域，因而可通过下列三种途径致癌,阻止NF-kB（p65/p50）与I-kB结合,丧失NF-kB在细胞质中的定位功能,强化NF-kB的转录调控活性,c-jun 和 c-fos 原癌基因,体内存在的AP-1转录调控因子，专一性地识别增强子中的TRE元件TGACTCA，并增强转录。AP-1是c-Jun和c-Fos的异源二聚体。v-Jun和v-Fos两个癌多肽也具有TRE元件的结合活性并促进转录，但已不能被信

28、号分子特异性磷酸化或脱磷酸化，因此v-Jun和v-Fos激活DNA转录不再依赖于特异性的磷酸化或脱磷酸化控制。,c-erbA 原癌基因,原癌基因c-erbA编码的是甲状腺激素受体，c-ErbA一旦与甲状腺激素结合，就能直接激活特殊靶基因的表达，其方式是受体直接结合在靶基因启动子或增强子的特异性应答元件上；而癌蛋白v-ErbA在N和C两端都缩小了，而且编码区也有少量变化，这使得它失去了与激素结合的能力。因此，v-ErbA不能激活靶基因的表达，而这些靶基因都是促进细胞分化的，关闭这些基因意味着细胞只能大量增殖分裂。,综上所述，涉及细胞信号转导途径各环节的蛋白质都有可能致癌，因此它们的编码基因都是原

29、癌基因。,5D 原癌基因活化的分子机制,长期以来人们就注意到，染色体畸变也能导致肿瘤发生。染色体畸变包括：转位、扩增、插入、缺失、修饰，以及基因点突变。从某种程度上来说，染色体畸变和基因突变与病毒基因组介导的突变其结果是一致的，即：使原癌基因转化为癌基因，所不同的是染色体畸变多由物理、化学等环境因素引起，而病毒基因组介导的突变多由生物因素引起，如基因重组等。,5D 原癌基因活化的分子机制,a 染色体扩增活化原癌基因,许多肿瘤细胞系存在可见的染色体扩增现象，这些扩增区域大都含有原癌基因。由c-myc、c-abl、c-myb、c-erbB、c-ras原癌基因诱导的各类肿瘤细胞中均伴有染色体的扩增，

30、其机理是原癌基因在扩增后的过量表达。,5D 原癌基因活化的分子机制,b 染色体插入活化原癌基因,有些原癌基因被激活是因为影响其表达效率，此时既不改变基因的拷贝数，也不影响其编码序列，而是在基因的邻近区域插入非缺陷型的逆转录病毒基因组，c-myc原癌基因被活化的主要机制就属此例。c-myc原癌基因含有三个外显子。第一个外显子为非编码区；第二和第三个外显子编码c-Myc蛋白。逆转录病毒ALV（鸟类白血病病毒）基因组可插在基因的三个不同位点上，活化原癌基因：,病毒基因组插在第一外显子与第二外显子之间,此时，病毒的LTR提供一个不受控制的强启动子，大幅度激活第二、第三两个外显子的转录。c-myc的转录

31、直接受到病毒控制，增加了c-Myc表达量，并且变异了的癌蛋白缺失了非编码区前导序列，其功能通常是控制表达程度,病毒基因组反向插在第一外显子的下游或内部,此时，病毒LTR上的启动子无活性，但其增强子却能发挥功能，增强位于第二外显子上游的次级启动子的转录启动作用。,病毒基因组插在整个基因的下游,此时，病毒LTR中的增强子由于其双向性，仍可增强原癌基因启动子的,转录启动作用。,达控制，导致表达量增加而致癌。,在上述三种情况中，c-myc的编码序列均未改变，只是失去了正常的表,通过这种逆转录病毒基因组插入染色体而被激活的原癌基因还包括c-erbB、c-myb、c-mos、c-raf、c-H-ras等。

32、,5D 原癌基因活化的分子机制,c 染色体转位活化原癌基因,通过转位作用使染色体DNA产生新的定位格局是原癌基因活化的另一种机制。,含c-myc原癌基因的染,位于人第8号染色体上的c-myc原癌基因通过染色体的转位作用转入IgH基因邻近，或转移到TCRa链编码基因邻近，这使得c-myc原癌基因的表达水平提高2-10倍，从而导致淋巴细胞,色体转位作用,瘤。,含c-abl原癌基因的染,这是发生在B淋巴细胞和T淋巴细胞中的另一种染色体转位现象。c-abl原癌基因编码的蛋白c-Abl是一酪氨酸激酶；v-abl癌基因编码产物的N末端序列发生变化，导致激酶自动活化并形成转化细胞的能力。Bcr-Abl的融合

33、蛋白也能使其磷酸激酶的活性处于无控制的活化状态。ALL：急性淋巴母细胞性白血病。CML：慢性骨髓性,色体转位作用,白血病。,5D 原癌基因活化的分子机制,d 染色体修饰活化原癌基因,与正常细胞相比，癌细胞染色体或染色质在结构上的普遍特征是呈现：,全方位和基因特异性的DNA低甲基化和超甲基化；,广泛的染色质组蛋白甲基化和乙酰化修饰。,上述修饰作用发生于染色质的组蛋白分子和DNA分子上，这种不改变基因序列结构、但能影响基因转录、进而操纵细胞生物表型的现象，称为生物性状的后生性或表观性（Epigenetics）。,DNA的低甲基化和超甲基化 from：Feinberg Nature 477,433,

34、2007,Me,Me,Me,转录激活,DNA的低甲基化（hypomethylation）,启动子 GC岛,原癌基因,Me,Me,Me,转录沉默,DNA的超甲基化（hypermethylation）,启动子 GC岛,原癌基因,Me,Me,在肿瘤组织中，很多促进生长的基因都是通过低甲基化而被激活的，这些基因包括胃癌中的HRAS、cyclin D2、maspin；肾细胞癌中的碳酸酐酶IX编码基因；结肠癌中的S100钙,结合蛋白A4编码基因等。,甲基化的位点主要集中在启动子的GC岛上。很多药物能诱导DNA的低甲,基化反应。,DNA的低甲基化和超甲基化 from：Feinberg Nature 477,

35、433,2007,Me,Me,Me,转录激活,DNA的低甲基化（hypomethylation）,启动子 GC岛,抑癌基因,Me,Me,Me,转录沉默,DNA的超甲基化（hypermethylation）,启动子 GC岛,抑癌基因,Me,Me,相反，肿瘤抑制基因的沉默则与其启动子的超甲基化相关联。第一个被描述的是与视网膜瘤有关的RB基因，此外还有很多的抑癌基因，如p16、VHL、MLH1、APC、E-cadherin等。甲基化的位点主要集,中在启动子的GC岛上。,染色质组蛋白的甲基化和乙酰化 from：Berger Nature 447,407,2007,REP：DNA结合型阻遏因子HDAC：

36、组蛋白脱乙酰化酶ACT：DNA结合型激活因子HAT：组蛋白乙酰化酶H3K27甲基化：转录沉默H3K4甲基化：转录激活H3K9乙酰化：转录激活,染色质组蛋白的甲基化和乙酰化 from：Feinberg Nature 477,433,2007,染色质修饰对癌细胞形成的贡献至少与DNA甲基化同等广泛和重要。例如在前列腺癌细胞中，组蛋白H3甲基转移酶过量表达，导致H3K27甲基化，很多基因转录抑制；在淋巴瘤和结肠直肠癌细胞中，组蛋白H4的Lys-16乙酰化（H4K16ac）以及Lys-20 三甲基化（H4K20 me3）的丧失，均导致相,关基因的转录沉默。,5D 原癌基因活化的分子机制,e DNA点突

37、变活化原癌基因,癌症的起源是由于一系列基因的突变导致细胞分裂生长优势。,Greenman 2007 Nature,Kan 2010 Nature,癌组织样品份数,癌组织DNA测序分析,测序DNA区域长度,体细胞突变数,蛋白质编码基因数,单碱基突变比列,错误突变/体细胞突变,无义突变/体细胞突变,剪切突变/体细胞突变,210,441,274 Mb,1800 Mb,518 kinase exon,1507 gene,1007,2576,91.5%,24.1%,61.6%,71.2%,5.4%,5.5%,2.8%,2.5%,癌基因中单碱基突变的类型与分布,from：Greenman et al.Na

38、ture 446,153,2007,调查结果显示：不同的癌细胞类型表现出不同的碱基取代谱；而且CT类型的突变最为普遍，这暗示了导致突变因素的重要性。,在神经胶质瘤和黑色素瘤中，,几乎全部是CT型的突变。,INDELS：插入/缺失突变,单碱基突变致癌的典型例子是c-ras原癌基因。从各种癌细胞中分离出来的ras癌基因与正常的原癌基因c-ras相比，均发生了点突变。这些点突变集中在c-ras基因的第12位密码子或第61位密码子上。同时，从肿瘤肉瘤病毒基因组中分离出来的v-ras基因与c-ras基因相比，也在第12位密码子上发生了点突变。所有的ras癌基因，不管是从病毒基因组中分离的还是直接从肿瘤细

39、胞中分离的，其第12位的密码子均由原来c-ras基因上的Gly转变成了其它氨基酸。如人膀胱癌细胞中的ras癌基因第12位密码子是GTC（Val），而c-ras基因则为GGC（Gly），一个碱基的突变便导致了致命的膀胱癌！,Ras 癌基因的点突变,进一步的研究表明：若将c-ras原癌基因第12位的Gly密码子变成其它18氨基酸（Pro除外），均可能转变为癌基因；同样，c-ras原癌基因第61位密码子若转变为其它17种氨基酸（Pro和Glu除外），也可变成癌基因。另外，若使正常的c-ras原癌基因过量表达（如20倍），则正常细胞也会转为癌细胞，这说明Ras蛋白的异常高活性（或量大或质好）是致癌的关

40、键因素之一。那么为什么Ras蛋白的第12位氨基酸改变会变成癌蛋白呢？,Ras 癌基因的点突变,Ras蛋白第12位和第61位氨基酸的功能,Ras蛋白为一21KD的G蛋白，其中5-22位和109-120位氨基酸残基为GTP/GDP结合区。第12位密码子Gly直接影响Ras对GTP的亲和程度，其它氨基酸取代Gly会导致Ras对GTP的亲和力大大增加，,Ras-GTP处于永久活化状态。,从而使Ras-GTP永久处于活化状态；第61位氨基酸的更换将改变Ras蛋白的空间构象，使之不易为GTPase激活蛋白（GAP）作用，从而导致,G-蛋白a亚基第201位精氨酸的突变效应,G-蛋白的一种a亚基GNAS突变会

41、导致包括一些癌症在内的多种人类疾病发生。GNAS中第201位的精氨酸缺失或取代是12%的卵巢癌和17%的乳腺癌发生的主要原因。结构分析显示，这一位点的突变很可能妨碍GNAS中GTPase活性的发挥，从而导致,Ga-GTP处于永久活化状态。,from：Zhengyan Kan et al.Nature 466,869,2010,5E 抑癌基因的作用原理,癌基因的形成或导入会导致机体肿瘤形成，但这决非肿瘤发生的充要条件，其实在很多情况下，癌基因的存在并不能使完整的动物机体致癌。将癌细胞与正常细胞融合，发现融合细胞都是正常生长的。在极少数情况下，极个别的融合细胞会转化成癌细胞。仔细分析这种癌细胞发现

42、，它们都伴随着染色体的缺失。在人的癌细胞中，缺失的区域大都发生在第11号、第13号、第17号染色体内，后来证明这些染色体上均有抗癌基因，它们实质上是生长阻遏基因Anti-oncogenes。,5E 抑癌基因的作用原理,a BRCA 肿瘤抑制基因,BRCA1肿瘤抑制基因是美国犹太大学医学院的Mark H.Skolnick在人第17号染色体上分离到的。之后，有三个研究小组鉴定了22种不同的BRCA1突变体，这些突变体的任何一种都会使人一生中有85%的可能性患乳腺癌。进一步的研究表明，BRCA1能有效地抑制乳腺癌和卵巢癌，但不影响结肠癌和肺癌，其作用机理是BRCA1促进乳腺细胞和神经细胞的分化与发育

43、。同年，Skolnick在第13号染色体上又发现了一个与乳腺癌有关的基因，命名为BRCA2，它的缺失会导致男子患乳腺癌，但BRCA1不会。,5E 抑癌基因的作用原理,b MTS1 抑癌基因,MTS1（Multiple Tumour Suppressor 1）多肿瘤抑制基因，编码周期素依赖性激酶-4抑制因子，简称p16ink4或CDK4-I。在多种人类恶性肿瘤中，普遍存在着染色体9q21-22区域的缺失。1993年Serrano等人从该区域克隆了这个基因。最近，Kamb等人又在MTS1基因附近发现了另一个抑癌基因，命名为MTS2。,MTS1抑癌基因的结构,MTS1基因位于人第9号染色体的短臂上，

44、a-干扰素基因与甲硫腺嘌呤磷酸化酶基因之间。其cDNA全长为444bp，包含3个外显子，编码148个氨基酸，编码蛋白的分子量为16KD，即p16。5 端126bp为,1外显子，中间307bp为第二外显子，3 端11bp为第3外显子。,MTS1蛋白的功能,真核生物细胞分裂过程中有两个关键性的决定位点：一是从G1期进入S期，DNA复制开始；二是从G2期进入M期，有丝分裂开始。周期素依赖型蛋白激酶是真核细胞分裂周期所必需的蛋白激酶家族，这个家族各成员的顺序活化导致细胞周期中关键分子的顺序磷酸化，借此有序地推进细胞分裂周期的进程。CDK4是这个家族中的一个重要成员，在细胞分裂周期的G1期，CDK4与周

45、期素D1形成复合物，通过磷酸化作用活化一系列分子，激发细胞从G1期进入S期，因此CDK4是调控真核细胞增殖的中心。MTS1通过与CDK4-周期素D1结合，抑,制CDK4的激酶活性，最终抑制细胞的增殖。,MTS1蛋白的功能,G1,S,G2,M,G0,CDK4,cyclin D1,CDK2,cyclin E,E2F,E2F,CDC2,cyclin AB,DNA复制开始,有丝分裂开始,MTS1,MTS1基因与肿瘤发生的关系,1994年Kamb等人对来自12种不同组织类型的290个肿瘤细胞系（肿瘤细胞的体外培养物）进行了系统性研究。结果表明：在这290个肿瘤细胞系中有133个细胞系发生MTS1基因的缺

46、失。几种主要肿瘤的缺失率为：肺癌25%；乳腺癌60%；黑色素瘤61%；血癌65%；星形细胞瘤82%；神经胶质瘤87%。同时发现在膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌中还存在着MTS1基因的点突变。为了排除上述结果是由于肿瘤细胞体外培养造成的假象，研究人员又进一步研究了原发性肿瘤中MTS1基因的改,变。14种癌症的200个种系原发肿瘤细胞均发现该基因的突变或缺失。,5E 抑癌基因的作用原理,c RB 抑癌基因,视网膜神经胶质瘤主要发病于儿童，这种病是偶尔发生的，家族一般无病史。大约三分之一的视网膜神经胶质瘤病人会导致多重癌症，通常是在两眼中。导致这种情况发生的是一个命名为RB的单一基因缺陷，其表达产物阻止视

47、网膜细胞的生长与分裂。一般的儿童在13号染色体上有两个正常的RB等位基因。如果其中一个基因偶尔被突发事件突变，另一个等位基因仍能发挥抗癌功能。只有当含有一个RB突变基因的视网膜细胞再次遭到突变，致使第二个RB基因失活，才会导致多重癌症发生，因此多重癌症的敏感性是遗传的。,5E 抑癌基因的作用原理,c RB 抑癌基因,视网膜胶质瘤,最新研究发现，RB基因的缺失不仅导致视网膜胶质瘤，而且在大约三分之一的人类肿瘤中发生突变。,RB基因表达产物的功能,RB抑癌基因定位于人第13号染色体的q14区域，现已被克隆鉴定。RB蛋白是一种影响细胞周期进程的核内磷酸化蛋白，分子量为105KD,因此又称为P105R

48、B。,RB基因表达产物的功能,在G0/G1期，RB不被磷酸化；在G1后期，RB被周期素-CDK复合物磷酸化；而在有丝分裂期（M期）被脱磷酸化。在S期之前，非磷酸化的RB能与几种蛋白结合，如E2F（一种转录调控因子）、周期素D（Cyclin D）和周期素E（Cyclin E）等。RB释放E2F、cyclinD、cyclinE的先决条件是RB的磷酸化，其后果是DNA复制进入S期。因此,持续进行。,RB蛋白缺失会导致E2F、cyclinD、cyclinE始终处于游离的活性状态，使得细胞的分裂,SV40 T抗原蛋白抑,SV40病毒的T-抗原蛋白能专一地与非磷酸化的RB结合，使之不能与E2F、Cycli

49、nD、CyclinE结合，因此病毒蛋白的存在和RB基因的缺失均能导致肿瘤形成,制RB蛋白的功能,5E 抑癌基因的作用原理,d p53 抑癌基因,p105RB发现后，人们又去寻找能与肿瘤病毒癌蛋白结合的其它蛋白质，结果找到了p53蛋白。p53是迄今发现的最重要的肿瘤抑制因子（以其分子量冠名），几乎所有的人类癌细胞缺失p53蛋白或其编码基因发生突变，而且大约一半的癌细胞还同时伴有p53蛋白的抑制因子、激活因子、下游靶蛋白发生故障。p53不仅控制细胞死亡和增殖，而且控制癌细胞的转移。Douglas R.Green&Guido Kroemer.Nature，458，1127，2009,p53蛋白的发现

50、,p53是一种核内磷酸化蛋白，最初是在SV40转化的细胞中发现的，能与T-抗原特异性结合。许多转化的细胞或者肿瘤细胞系中均伴随着p53蛋白的激增，而且在早期的实验中发现，导入克隆的p53编码基因能使细胞获得永生性，因而被归为癌基因。但后来发现，所有转化细胞所表达的p53均为其突变形式，突变了的p53以量上的压倒优势在与细胞内正常p53的竞争中获胜，其机制是p53的突变亚基与正常亚基形成异常构,象的异源四聚体，进而阻止正常亚基发挥作用。,p53基因的定位,p53基因定位于人的第17号染色体上。两个p53等位基因缺失或一个等位基因内部发生点突变，均会导致其突变优势效应，而且这两种情况均分别存在于人