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1、第三部分 微生物的生长,第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法,一、获得纯培养的方法,纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.,（1）液体稀释法（2）平板划线分离法（Streak Plate）（3）平板涂布分离法（Spread Plate）（4）选择性培养分离法（5）单细胞（单孢子）分离法,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生
2、物.,（1）液体稀释法,（2）平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.,（3）平板涂布分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造成机械损伤,Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.,（4）选择性培养分离法,为了从混杂的
3、微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,（5）单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,二、微生物生长量的测定方法,（一）微生物细胞数目的检测法1。总菌数的测定（计数器直接计数，染色涂片计数，比浊法）2。活菌数的测定（平板计数法
4、、液体稀释法、膜过滤法）,（二）微生物生长量的测定,1。直接法(干重法，体积法)2。间接法（比浊法，碳、氮含量法，DNA测定法等）,1.血球计数板法,原理：将1mm20.02mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,2.涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数
5、。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数涂布面积/视野面积10稀释倍数,3.平板菌落计数法,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,4。薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤
6、，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,5.干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。该法适合菌浓度较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,6.比浊法,原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就
7、可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。,7.生理指标法,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,第二节 微生物的生长曲线,一、微生物培养：研究群体生长规律，首先应对微生物进行培养。培养的方法有：分批培养和连续培养 这两种方法既可用于纯种培养，也可用于混合,1 分批培养（batch c
8、ulture）：,分批培养（batch culture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获,2 连续培养（continuous culture）,连续培养（continuous culture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。类型：恒浊连续培养和恒化连续培养,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡
9、，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,（1）连续培养原理,恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究及污水生物处理。,恒化器Chemostat 或bactogen,概念：调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节
10、新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,恒浊连续培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒浊器与恒化器的比较,二、细菌的纯培养生长曲线,将少量细菌接种到一种新鲜的、定量的液体培养基中进行分批培养，定时取样计数，以细菌个数或细菌数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，连接坐标纸上各点成一条曲线即细菌的生长曲线。生长曲线可以细分为六个阶段、四个
11、时期：延迟期（停滞期）、加速期、对数生长期、减速期、稳定期（静止期）、衰亡期（或死亡期）。,典型的生长曲线（Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同,加速期,减速期,其它名称：迟滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点生长速率=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,.停滞期（lag
12、 phase）,.对数期（logarithmic phase）,其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：生长速率最大，即代时最短菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素：菌种代谢产物营养物浓度氧气,.静止期（stationary phase）,又称：稳定期或最高生长期特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的活细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳
13、的收获时期。若目标是菌体，则在静止期初期就要及时收获菌体。产生原因：营养物浓度的降低 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）的改变;溶解氧供应不足,.衰亡期（decline phase）,特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。细胞进行内源性呼吸（因为营养缺乏），出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,第三节 影响微生物生
14、长的主要因素,一、温度二、氧气三、pH,一、温度对微生物生长的影响,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性。温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性。温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度。对生长有影响。,最低生长温度:指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度：指使微生物迅速生长的温度。最高生长温度：指微生物生长繁殖的最高温度界限。,微生物处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚
15、至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,根据微生物的最适生长温度分类,嗜冷微生物嗜温微生物嗜热微生物超嗜热或嗜高温微生物,二、pH,pH值对微生物生长的影响机制影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,一些微生物的生长酸碱度,大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5；放线菌在中性偏碱性的环境pH为7.5-8.0，霉菌与酵母在酸性环境pH为5-6和3-6
16、。,三、溶解氧,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌:好氧菌 微好氧菌：兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌：厌氧菌(专性)厌氧菌：,专性好氧菌（strict aerobe）P128必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。兼性好氧菌（facultative aerobe）在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD、过氧化氢酶和脱氢酶。厌氧菌（anaerobe）分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,
