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1、实验一、RNA提取方法及原理,一、研究背景二、方法及原理,一、研究背景,1.RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。,2 RNA分布,二、方法及原理,1、RNA的提取流程（1）样本前处理（2）细胞裂解（3）RNA的纯化及获得,RNA提取流程 样品前处理注意点,选择新鲜血液，不得超过4小时,选择新鲜
2、的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜组织，生长旺盛的组织,可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70保存较长时间,去掉培养基，加入一定量TRNzol-70 保存较长时间,推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存,液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融,RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本,RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA,异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂,独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒,RNA提取流程 RNA的纯化及获得,RNA纯化要求,1 纯化后不应存
3、在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2 排除有机溶剂和金属离子的污染3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染,2.RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染a.严格戴好口罩，手套。b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。,阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。b.选择合适的裂解液。c.控制好样品的起始量。,明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。b.RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。,Rn
4、ase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶,复习核酸的提取方法,RNA的提取苯酚水溶液提取细胞破碎 匀浆等体积90苯酚水溶液振荡RNA、Pro分开RNA、多糖（水层）；DNA、Pro（苯酚层）冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂,复习核酸的提取方法,DNA提取浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNAPro，再用浓盐提取也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro,复习核酸的提取方法,核酸的沉淀DN
5、A的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5.收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,Trizol试剂提RNA的原理,Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA
6、存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,TRIzol法提取流程1.样品处理：组织：取 100mg 组织（新鲜或-70 及液氮中保存的组织均可）置匀浆器中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，匀浆液转1.5ml 离心管中,室温静置 min。2.加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s，静置 2min。3.4 离心，13000g 15min，取上清。4.加入 与上清1:1的异丙醇(约0.5ml)，将管中液体轻轻混匀，室温静置 20min(-20
7、，时间长效果更好)。取200-300ul从5步往下做。,TRIzol法提取流程,5.4 离心，13000g 10min，弃上清。6.加入 1ml 75%乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打碎。4，13000g 5min，弃上清。7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎)8.晾干，加入适量的 H 2 O 溶解（100ul）（65 促溶 10-15min）。9.定量。,细胞,实验流程图,细胞选择,贴壁细胞 悬浮细胞,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不
8、充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,RNA降解,冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,OD260/OD280 比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的
9、离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260/OD280 比值偏低,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,电泳带型异常,非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要
10、差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,RNA的保存,短期保存：可将RNA溶解于TE缓冲液(10mmolL Tris，1mmolL EDTA)或无：RNA酶水(0.1mmolL EDTA)中，保存于一20。在保存RNA样品时，通常使用EDTA来螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的是，许多实验室配制EDTA后常使用很长时间甚至数年，这种长期使用的EDTA溶液常有微生物存在，反而会造成RNA酶的污染。中长期保存：相对于一20，一80可进一步防止RNA降解。可将RNA溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中，保存于一80，通常可保存6个月左右。长期保存：保存RNA最为稳定的方法是经乙醇沉淀后，直接保存于一80(在纯化RNA的清洗步骤中，离心后不要弃上清，将RNA保存于乙酸铵乙醇溶液中)。对于已经纯化好的RNA，如果为离心后的RNA沉淀，可加入70乙醇，保存于-80。如果为溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中的RNA样品，可加入2倍体积的无水乙醇，保存于-80。,
