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1、实验一 蛋白质的吸光分析测定,张亚东 谭理,实验目的,通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、实验步骤了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。,实验原理,改良Lowry法 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质-铜复合物。(双缩脲反应)蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原,生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物,蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线,测定样品中蛋白质含量。(还原反应),改良lowry法的原理图,650nm,Coomassie亮蓝法Coomas
2、sie亮蓝G250能与蛋白质的疏水区域结合,这种结合具有高度敏感性,G250与蛋白质形成的复合物成蓝色,在595nm处有最大吸收峰,颜色深浅与蛋白质浓度成正比关系,通过建立标准曲线可测定未知蛋白浓度。,紫外分光光度法有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸,在紫外光280nm处有最大吸收峰,故可根据280nm处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。在生物样品中还可能会含有核酸等成分,在280nm处也有吸收,它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除核酸的影响 蛋白质浓度1.45A2800.74A260,波长 260 280,实验步骤,改良Lowry法,混匀后置于50度水浴中保温1
3、0分钟,冷却 室温放置10分钟 立即混匀,置于50度水浴中保温10分钟,冷却后在650nm处比色,改良Lowry法蛋白质浓度测定,制备标准曲线,根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度,Coomassie亮蓝法,摇匀,室温静置3分钟,以第六管为对照,于595nm波长比色,读取吸光度。,制备标准曲线,根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度,紫外分光光度法 取待测样品稀释液,以蒸馏水为对照,在紫外分光光度计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值,根据经验公式计算蛋白浓度 蛋白质浓度1.45A2800.74A260,实验仪器,实验讨论和注意事项,比色法是常用的测定浓度的方法,其关键点在于标准曲线的制备一定要精确。标准样品的配置浓度是否精确直接影响实验的结果,因此要正确掌握加样枪、移液管的操作,保证标准样品配置的准确。对于分光光度计的使用要正确掌握,注意调节波长。正确的进行仪器的调试和测定,保证结果的准确。,